Protokoll für die RNAi-Assays in Adult Moskitos (A. gambiae)

Summary

Reverse-genetische Ansätze haben sich als äußerst nützlich für die Bestimmung, welche Gene zugrunde liegenden Widerstand gegen Vektor Krankheitserreger in Mücken. Dieses Video-Protokoll stellt ein Verfahren durch die Dimopoulos Labor verwendet werden, um dsRNA in Anopheles gambiae Mücken, die den Malaria-Parasiten Hafen zu injizieren. Die Technik die Manipulation der Injektion Setup und Injizieren dsRNA in den Brustkorb dargestellt.

Abstract

Reverse-genetische Ansätze haben sich als äußerst nützlich für die Bestimmung, welche Gene zugrunde liegenden Widerstand gegen Vektor Krankheitserreger in Mücken. Dieses Video-Protokoll stellt ein Verfahren durch die Dimopoulos Labor verwendet werden, um dsRNA in Anopheles gambiae Mücken, die den Malaria-Parasiten Hafen zu injizieren. Die Technik die Manipulation der Injektion Setup und Injizieren dsRNA in den Brustkorb dargestellt.

Protocol

RNAi-vermittelten Gen-Silencing in Mücken, bedarf der vorherigen Herstellung und Reinigung von spezifischen dsRNAs, dass das Gen von Interesse Ziel. Für dsRNA-Synthese, empfehlen wir die Ambion Megascript Kit, Verwendung eines T7-RNA-Polymerase-vermittelte in vitro Transkriptions-Reaktion macht. Für dsRNA Reinigung empfehlen wir die Qiagen RNeasy-Kit. Proben von dsRNA zu quantifizieren und angepasst werden, um 3 ug / ul in Wasser. Andere Materialien, die Sie benötigen sind: spitzen Pinzette, Objektträger a…

Discussion

Effizienz der Gen-Silencing ist sehr variabel und hängt von einer Reihe von Faktoren, einschließlich Transkript und Protein turn-over-Raten und dsRNA Aufnahme Effizienz von Zellen und Organen. Wir haben festgestellt, dass Schweigen so früh wie 1 Tag nach der Injektion beginnt und kann bis zu 6 Tage nach der Injektion andauern. Verwenden Sie Transkript und Protein Nachweismethoden wie quantitative PCR und Western-Blot zu Schweigen zu validieren.

Materials

Material Name	Tipo	Company	Catalogue Number	Comment
Megascript	kit	Ambion		for dsRNA synthesis; T7 RNA polymerase-mediated in vitro transcription reaction
RNeasy		Qiagen		For dsRNA purification
dsRNA				should be quantified and adjusted to 3 μg/ μL in water
fine-tipped forceps
glass slide
glass microcapillary needles
microinjector		Drummond	Nanoject II
light microscope				mounted above a cold block
Petri dish				covered, glass
paper towels
10% sucrose	food
A. gambiae	Animal			mosquitos