I många biologiska och kliniska situationer är det fördelaktigt att studera cellulära processer som de utvecklas i sitt hemland mikromiljö. Här beskriver vi montering och användning av en låg kostnad fiberoptiska mikroskop som kan ge realtid bildbehandling i cellkultur, djurstudier och kliniska studier patient.
Många biologiska och kliniska studier kräver longitudinell studie och analys av morfologi och funktion med cellnivå upplösning. Traditionellt finns flera experiment parallellt med individuella prover bort från studien vid sekventiell tidpunkter för utvärdering av ljusmikroskop. Flera intravital har utvecklats, med konfokal, multiphoton, och andra övertonen mikroskopi alla visar sin förmåga att kunna användas för avbildning på plats 1. Med dessa system är dock nödvändig infrastruktur komplexa och dyra, med scanning och komplexa ljuskällor. Här presenterar vi ett protokoll för konstruktion och montering av en högupplöst microendoscope som kan byggas på en dag med off-the-shelf komponenter för under US $ 5000. Plattformen erbjuder flexibilitet när det gäller bildupplösning, fält-of-view, och drift våglängd, och vi beskriva hur dessa parametrar kan enkelt ändras för att möta de särskilda behoven hos slutanvändaren.
Vi och andra har undersökt användningen av högupplösta microendoscope (HRME) i cellodling in vitro 2-5, i censurerade 6 och levande vävnader djur 2,5, och i mänskliga vävnader in vivo 2,7. Användare har rapporterat att använda flera olika fluorescerande kontrastmedel, inklusive proflavine 2-4, benzoporphyrin-derivat monoacid ring A (BPD-MA) 5, och fluoroscein 6,7, som alla har fått full eller prövningsläkemedel godkännande från FDA för användning på människor. Högupplöst microendoscopy, i den form som beskrivs här, kan överklaga till ett brett spektrum av forskare som arbetar i de grundläggande och kliniska vetenskaper. Tekniken erbjuder en effektiv och ekonomisk metod som kompletterar traditionell bänk mikroskopi, genom att ge användaren att utföra högupplösta, längsgående avbildning på plats.
Den högupplösta microendoscopy teknik som beskrivs här ger forskare inom den grundläggande biomedicinska och kliniska forskningsområden med en flexibel, robust och kostnadseffektiv metod för att visualisera cellulära detaljer på plats. Vi har beskrivit ett protokoll för montering av bildsystem och visat sin användning i cellodling in vitro, och i djur, och mänskliga vävnader in vivo. Medan avbildning resultat som presenteras här används proflavine som fluorescerande kontrastmedel har andra grupper visat versioner av systemet med LED-belysning våglängder och filter valt att matcha excitation / emission spektra av andra färgämnen 5-7.
Upplösning och field-of-view initialt bestäms av core-to-core avstånd och bildbehandling diameter fiberoptiska paket. Vi har använt buntar med ca 4 ìm core-kärna avstånd och diametrar avbildning av 330 ìm (film 1), 720 ìm (figur 2, figur 3a, b) och 1400 ìm (figur 3c). De mindre buntar som kan skickas genom smalare spårvidd nålar och är betydligt mer flexibel än de större fibrer. Vi och andra 8 har i vissa fall observerat uppkomsten av autofluorescens utsläpp från fibern bunt själv. När du försöker väcka fluoroforer på UV-våglängder, eller samla utsläpp i den röda spektralområdet bör uppmärksamhet fästas vid nivån av fiber bunt autofluorescens bidrar till den totala uppmätta signalen.
Medan de flesta av de högupplösta microendoscopy arbete rapporterats hittills har använt en bar fiber bunt, kan ytterligare förstoring ges med hjälp av GRIN linser bundna till den distala spetsen. GRIN linser erbjuder ett enkelt och ekonomiskt sätt att öka rumslig upplösning, fastän deras känslighet för optiska avvikelser och begränsad NA är väl erkänt. Om GRIN objektivets prestanda är otillräcklig för en viss tillämpning, hybrid GRIN / sfärisk mål lins 9 eller miniatyr mål församlingar lins 10-11 kan utnyttjas.
Den högupplösta microendoscope beskrivs här i huvudsak fungerar som ett brett fält epi-fluorescensmikroskop, därför utan optisk sektionering (som i konfokala eller icke-linjära mikroskopi) är att vänta. Vår erfarenhet är att använda 455 ljus nm excitation och aktuella proflavine som kontrastmedel, är ljuset i första hand samlas in från ett djup som motsvarar ett par cellager.
Detta protokoll borde göra det möjligt för läsaren att montera den högupplösta microendoscope på bänk, med ett kompakt fotavtryck av 10 "x 8". Om så önskas kan systemet vara innesluten i en låda och elektriska komponenter (LED och kamera) drivs av ett batteri (figur 1d). Många kompaktkameror kan drivas av IEEE-1394 (Firewire) och USB-portar på värddatorn.
The authors have nothing to disclose.
Denna forskning har delvis finansierats av National Institutes of Health, bevilja R01 EB007594, försvarsdepartementet Breast Cancer Research Program, förslag BCO74699P7 och Susan G. Komen Foundation 26152/98188972.
Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
CCD camera | Point Grey Research | GRAS-14S5M | ||
LED | Thorlabs | M455L2 | Selected for use with proflavine – other fluorophores may require different parts | |
Excitation filter | Semrock | 452/45 | Selected for use with proflavine – other fluorophores may require different parts | |
Emission filter | Semrock | 550/88 | Selected for use with proflavine – other fluorophores may require different parts | |
Dichroic mirror | Chroma | 485 DCLP | Selected for use with proflavine – other fluorophores may require different parts | |
Objective lens | Thorlabs (Olympus) | RMS 10X | ||
Tube lens | Thorlabs | AC-254-150-A1 | Select focal length to achieve required magnification to CCD | |
Condenser lens | Thorlabs | ACL2520 | ||
Cage cube unit | Thorlabs | C6W, B1C, B3C, B5C, SM1CP2 | ||
Cage rods and plates | Thorlabs | ER05 (x4), ER1.5 (x2), ER2 (x2), ER6 (x2), CP02 (x3) | ||
Fold mirror unit | Thorlabs | KCB1, PF10-03-G01 | ||
Lens tubes | Thorlabs | SM1L05, SM1L30, SM1V05 (or SM1Z) | ||
Adapters / couplers | Thorlabs | SM1A3, SM1A9, SM1T2 (x2) | ||
SMA connectors | Thorlabs | SM1SMA, 11040A | ||
LED driver | Thorlabs | LEDD1B TPS001 | ||
Fiber optic bundle | Sumitomo | IGN-08/30 | Larger or smaller bundles are available (Sumitomo / Fujikura) |