Combinación de adhesivo basado en cinta de muestreo y de fluorescencia In situ La hibridación para la detección rápida de Salmonella En los productos frescos
Summary
Este protocolo describe un simple adhesivo cinta enfoque basado en el muestreo de tomate y otras superficies de los productos frescos, seguido por la rápida detección de células enteras de<em> Salmonella</em> Mediante fluorescencia<em> In situ</em> Hibridación (FISH).
Abstract
Este protocolo describe un método sencillo para que el adhesivo, la cinta basada en el muestreo de tomate y otras superficies de los productos frescos, seguido por fluorescencia en cinta de hibridación in situ (FISH) para un rápido cultura independiente de la detección de Salmonella spp. Cintas cargadas de células también puede ser colocado boca abajo en agar selectivo para la fase sólida de enriquecimiento antes de la detección. Por otra parte, bajo volumen de enriquecimiento líquido (miniculture superficie del líquido) se puede realizar en la superficie de la cinta en el no selectivo caldo, seguidos por el pescado y el análisis mediante citometría de flujo. Para comenzar, cinta adhesiva estéril se pone en contacto con productos frescos, se aplica presión leve, y de retirar la cinta, de extraer físicamente los microbios presentes en estas superficies. Las cintas están montadas pegajoso hacia arriba en portaobjetos de vidrio y las células de la muestra se fijan con formol al 10% (30 min) y deshidratados mediante una serie gradual de etanol (50, 80, y 95%, 3 min cada concentración). A continuación, las células cargadas las cintas se han manchado con un tampón que contiene un cóctel de ADN de Salmonella objetivo de la sonda y se hibridaron durante 15 – 30 min a 55 ° C, seguido de una breve aclaración en un tampón de lavado para eliminar la sonda no unido. Adherente, PESCADO marcado células se contrastados con el ADN tinte 4 ',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) y los resultados se ven usando la microscopía de fluorescencia. Para la fase sólida de enriquecimiento, las células cargadas las cintas se colocan boca abajo sobre una superficie de agar selectivo adecuado y se incuban para permitir el crecimiento in situ de microcolonias Salmonella, seguidos por el pescado y la microscopia como se describió anteriormente. Para miniculture superficie del líquido, las células cargadas las cintas se colocan lado pegajoso hacia arriba y una cámara de perfusión de silicona se aplica para que la cinta y la forma del portaobjetos del microscopio la parte inferior de una cámara hermética en la que un pequeño volumen (≤ 500 l) de tripticasa de soja caldo (TSB) se introduce. Los puertos de entrada están cerrados y las cámaras se incuban a 35 – 37 ° C, permitiendo que el crecimiento basado en la amplificación de extraer la cinta-microbios. Después de la incubación, los puertos de entrada son sin sellar, las células se separan y se mezclan con la espalda vigorosa y pipeteo adelante, cosechadas por centrifugación y se fija en 10% neutros formalina tamponada. Finalmente, las muestras se hibridan y se examina a través de citometría de flujo para revelar la presencia de Salmonella spp. Como se describe aquí, nuestra "cinta-FISH" enfoque puede proporcionar un muestreo simple y rápida y la detección de Salmonella en las superficies de tomate. También hemos utilizado este enfoque para el muestreo de otros tipos de productos frescos, como la espinaca y chiles jalapeños.
Protocol
Discussion
Métodos sencillos y rápidos para la detección de patógenos en las superficies de los productos pueden ayudar a mitigar las enfermedades transmitidas por los alimentos, proporcionando información oportuna y procesable. Adhesivo a base de cinta de métodos de muestreo se han utilizado en el medio ambiente, clínica y microbiología de los alimentos desde la década de 1950 e implican apremiantes de "Scotch" al estilo de la cinta a la superficie para la eliminación de microorganismos, seguido por el examen …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
La financiación de este trabajo fue proporcionado por un premio del Fondo de crecer Iowa Valores de BFBS.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Fungi-Tape sampling tape | Scientific Device Laboratory, Des Plaines, IL | 745 | http://www.scientificdevice.com/ | |
| Con-Tact-It sampling tape | Birko Corporation, Denver, CO | http://www.birkocorp.com/ | ||
| Clear office tape, generic | Various suppliers | Should be optically clear, have low intrinsic fluorescence | ||
| Food surface | Local grocery | Tomatoes (red tomatoes on the vine, not waxed or oiled) used here | ||
| Trypticase Soy Broth | Difco, Sparks, MD | 211768 | For non-selective liquid surface miniculture enrichment | |
| Xylose-lysine-Tergitol 4 agar base | Difco, Sparks, MD | 223420 | For Salmonella-selective agar (XLT-4) | |
| Xylose-lysine-Tergitol 4 agar supplement | Difco, Sparks, MD | 235310 | For Salmonella-selective agar (XLT-4) | |
| Formalin solution | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | HT5011 | 10% solution, neutral, buffered (cell fixative) | |
| Absolute ethanol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | E7023 | Molecular biology grade (pre-hybridization dehydration) | |
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | Various suppliers | RNase- and DNase-free | ||
| Microscope slides and cover slips | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | |||
| NaCl solution | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | S5150 | Molecular biology grade, 5M solution (hybridization buffer component) | |
| Tris-EDTA buffer solution (100X concentrate) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | T9285 | 1M Tris [pH 8.0], 0.1M EDTA (hybridization buffer component) | |
| Sodium dodecyl sulfate solution | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | L4522 | 10% solution in 18 megohm water (hybridization buffer component) | |
| Sal3 and Salm-63 oligonucleotide probes | Integrated DNA Technologies, Coralville, IA | 5’-labeled with 6-carboxyfluorescein (FAM) or Texas Red (for microscopy) or Cy5 (for cytometry), HPLC-purified | ||
| Variable speed microcentrifuge | Various suppliers | Use rotor diameter to calculate RPM needed for RCF values described in protocol | ||
| CoverWell perfusion chamber | Grace Bio-Labs Inc., Bend, OR | PC1R-2.0 | Non-sterile | |
| Gel loading pipette tips (FS MultiFlex) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 05-408-151 | Long, thin tips for easy access to small sampling ports and maneuverability within chamber | |
| Aluminum heat block or precision-controlled heating station | Various suppliers | Eppendorf Thermomixer R dry block heating and cooling shaker used here | ||
| Bambino mini hybridization oven | Boekel Scientific, Feasterville, PA | Model 230300 | Slides are placed in 50 ml polypropylene centrifuge tubes for hybridization, heat transfer not direct | |
| Slide Moat slide hybridizer | Boekel Scientific, Feasterville, PA | Model 240000 | Provides rapid, direct transmission of heat through glass slide | |
| Vectashield H-1200 mounting medium with 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA | H-1200 | Minimizes quenching of fluorescence during microscopy, provides DAPI counterstain | |
| Fluorescence microscope | Various suppliers | Leitz Laborlux S used here | ||
| Digital camera | Various suppliers | Canon PowerShot A640 camera used here | ||
| Image acquisition software | Various suppliers | Axiovision software v. 4.6 (Carl Zeiss) used | ||
| Adobe Photoshop | Adobe Inc. | For minimal processing of images (overlay of images taken in different channels) | ||
| Flow cytometer | Various suppliers | FACSCanto flow cytometer (BD Biosciences, San Jose, CA) with red (647 nm) excitation used | ||
| Flow cytometry analysis software | Various suppliers | FlowJo software v. 8.7.1 (Tree Star, Inc.) used |
Referências
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