Этот протокол описывает простую клей-ленты на основе подход к отбору проб из помидоров и другой свежей поверхности продукции, с последующим быстрым целом обнаружения ячейки<em> Сальмонеллы</em> С помощью флуоресцентной<em> На месте</em> Гибридизации (FISH).
Этот протокол описывает простой подход для клея-ленты на основе выборки из помидоров и других свежих поверхностей производят, а затем на ленту флуоресценции в гибридизация (FISH) для быстрого культуры независимой обнаружения бактерии рода сальмонелла. Сотовые заряженные ленты могут также быть помещены лицевой стороной вниз на селективном агаре для твердофазной обогащения до обнаружения. Кроме того, низкие объемы жидкости обогащения (жидкие miniculture поверхности) могут быть выполнены на поверхности ленты в неселективных бульон, а затем FISH и анализ с помощью проточной цитометрии. Во-первых, стерильные клейкой ленты приводят в контакт со свежими продуктами, нежное давление применяется, и лента удаляется, физически извлечения микробы присутствуют на этих поверхностях. Ленты крепятся липкой стороной вверх на предметные стекла микроскопа и стекла пробы клетки фиксировали 10%-ного формалина (30 мин) и обезвоженной использованием градуированных серии этаноле (50, 80 и 95%; 3 мин каждой концентрации). Затем клетка заряженные ленты пятнистый с буфером, содержащим Salmonella ориентированных коктейль ДНК-зонда и гибридизовали в течение 15 – 30 мин при 55 ° С с последующим кратким полоскания в стиральной буфера для удаления несвязанного зонда. Приверженец, FISH-меченых клеток, затем контрастно с ДНК красителя 4 ',6-diamidino-2-фенилиндола (DAPI), а результаты просматривать с помощью флуоресцентной микроскопии. Для твердой фазы обогащения, сотовые заряженные ленты расположены лицевой стороной вниз на подходящей поверхности селективного агара и инкубировали, чтобы на месте рост сальмонелл микроколоний, а затем FISH и микроскопии, как описано выше. Для жидких miniculture поверхности клеточной взимается ленты размещены липкой стороной вверх и камеры силиконовые перфузии применяется таким образом, чтобы лента и стекло микроскопа форма нижней части водонепроницаемую камеру, в которой малый объем (≤ 500 мкл) Trypticase Соевый Отвар (БСЭ) вводится. Впускные отверстия герметизируются и камер инкубируют при 35 – 37 ° C, что позволяет на основе роста усиления ленты экстрагировали микробов. После инкубации, впускные порты распечатал, клетки отделяются и смешивается с энергичным и обратно пипетки, собранных с помощью центрифугирования и фиксировали в 10% нейтральный буферный формалин. Наконец, образцы гибридизированных и исследовали с помощью проточной цитометрии выявить наличие бактерии рода сальмонелла. Как описано здесь, наш «Лента-FISH" подход может обеспечить простой и быстрый отбора проб и обнаружения сальмонеллы в томатном поверхностей. Кроме того, мы использовали этот подход для отбора проб другие виды свежих продуктов, включая шпинат и халапеньо перец.
Простые и быстрые методы для обнаружения патогенов на производство поверхности могут помочь смягчить болезней пищевого происхождения путем предоставления своевременной и актуальной информации. Скотч основе методов выборки были использованы в экологические, клинические и микробио?…
The authors have nothing to disclose.
Финансирование этих работ было предоставлено расти Айова Значения фонда награду BFBS.
Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
Fungi-Tape sampling tape | Scientific Device Laboratory, Des Plaines, IL | 745 | http://www.scientificdevice.com/ | |
Con-Tact-It sampling tape | Birko Corporation, Denver, CO | http://www.birkocorp.com/ | ||
Clear office tape, generic | Various suppliers | Should be optically clear, have low intrinsic fluorescence | ||
Food surface | Local grocery | Tomatoes (red tomatoes on the vine, not waxed or oiled) used here | ||
Trypticase Soy Broth | Difco, Sparks, MD | 211768 | For non-selective liquid surface miniculture enrichment | |
Xylose-lysine-Tergitol 4 agar base | Difco, Sparks, MD | 223420 | For Salmonella-selective agar (XLT-4) | |
Xylose-lysine-Tergitol 4 agar supplement | Difco, Sparks, MD | 235310 | For Salmonella-selective agar (XLT-4) | |
Formalin solution | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | HT5011 | 10% solution, neutral, buffered (cell fixative) | |
Absolute ethanol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | E7023 | Molecular biology grade (pre-hybridization dehydration) | |
1.5 ml microcentrifuge tubes | Various suppliers | RNase- and DNase-free | ||
Microscope slides and cover slips | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | |||
NaCl solution | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | S5150 | Molecular biology grade, 5M solution (hybridization buffer component) | |
Tris-EDTA buffer solution (100X concentrate) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | T9285 | 1M Tris [pH 8.0], 0.1M EDTA (hybridization buffer component) | |
Sodium dodecyl sulfate solution | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | L4522 | 10% solution in 18 megohm water (hybridization buffer component) | |
Sal3 and Salm-63 oligonucleotide probes | Integrated DNA Technologies, Coralville, IA | 5’-labeled with 6-carboxyfluorescein (FAM) or Texas Red (for microscopy) or Cy5 (for cytometry), HPLC-purified | ||
Variable speed microcentrifuge | Various suppliers | Use rotor diameter to calculate RPM needed for RCF values described in protocol | ||
CoverWell perfusion chamber | Grace Bio-Labs Inc., Bend, OR | PC1R-2.0 | Non-sterile | |
Gel loading pipette tips (FS MultiFlex) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 05-408-151 | Long, thin tips for easy access to small sampling ports and maneuverability within chamber | |
Aluminum heat block or precision-controlled heating station | Various suppliers | Eppendorf Thermomixer R dry block heating and cooling shaker used here | ||
Bambino mini hybridization oven | Boekel Scientific, Feasterville, PA | Model 230300 | Slides are placed in 50 ml polypropylene centrifuge tubes for hybridization, heat transfer not direct | |
Slide Moat slide hybridizer | Boekel Scientific, Feasterville, PA | Model 240000 | Provides rapid, direct transmission of heat through glass slide | |
Vectashield H-1200 mounting medium with 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA | H-1200 | Minimizes quenching of fluorescence during microscopy, provides DAPI counterstain | |
Fluorescence microscope | Various suppliers | Leitz Laborlux S used here | ||
Digital camera | Various suppliers | Canon PowerShot A640 camera used here | ||
Image acquisition software | Various suppliers | Axiovision software v. 4.6 (Carl Zeiss) used | ||
Adobe Photoshop | Adobe Inc. | For minimal processing of images (overlay of images taken in different channels) | ||
Flow cytometer | Various suppliers | FACSCanto flow cytometer (BD Biosciences, San Jose, CA) with red (647 nm) excitation used | ||
Flow cytometry analysis software | Various suppliers | FlowJo software v. 8.7.1 (Tree Star, Inc.) used |