Органотипической культуре Кусочек GFP-экспрессирующих эмбрионов мыши для реального времени изображений периферической нервной вырост
Summary
Мы представляем способ получения органотипической ломтиками середине беременности эмбрионов мыши для выращивания и замедленная съемка периферического отросток нерва.
Abstract
Для многих целей, культивирование естественных мыши бывший эмбрионов в качестве органотипической ломтиками желательно. Например, мы используем линию трансгенных мышей (tauGFP), в котором расширенная версия зеленого флуоресцентного белка (EGFP) исключительно экспрессируется во всех нейронов развивающихся центральной и периферической нервной системы 1, что позволяет возможность как фильм иннервации передних конечностей и манипулировать этим процессом с фармакологическими и генетическими методами 2. Наиболее критичным параметром в успешном выращивании таких культур срез метод, посредством которого ломтиками готовы. После обширного тестирования различных методов, мы обнаружили, что vibratome является наилучшим устройством для среза эмбриона, что они обычно приводят к культуре, которая демонстрирует жизнеспособность в течение нескольких дней, и, самое главное, развивается в возрасте конкретным образом. Для середине беременности эмбрионы, это включает в себя нормальным следствием спинальных нервов из спинного мозга и спинной ганглий корня до своих целей на периферии и правильного определения костной и мышечной ткани.
В этой работе мы представляем метод обработки целых зародышей эмбриональных день (E) E10 в E12 на 300 – 400 мкм ломтиками для выращивания в стандартной тканевой культуры инкубатор, который может быть изучен на срок до двух дней после среза подготовки. Решающее значение для успеха такого подхода является использование vibratome резать каждый агарозном встраиваемый эмбриона. Это сопровождается выращивания ломтиками на Millicell культуры мембраны вставки помещается на небольшой объем среды, в результате чего техника культуре интерфейс. Один помете в среднем по 7 эмбрионов обычно производит не менее 14 ломтиков (2-3 ломтика передних конечностей региону в эмбрион), который немного отличается из-за возраста эмбрионов, а также толщина ломтиков. Около 80% культурных ломтиками показать нерва результат, который можно измерить througout 2 периода культивирования. Представитель результаты, используя линию tauGFP мыши продемонстрировали.
Protocol
Discussion
В обширной сравнения методов для подготовки эмбриональных культур кусочек середине беременности эмбрионов мыши (E10 – E12), мы заметили, что vibratome производит без сомнения, наиболее надежные результаты в отношении как общей жизнеспособности культур и воспроизводимость шаблоны нерва резул…
Acknowledgements
Авторы выражают благодарность первоисточник для идеей является выполнять срез культуры от эмбрионов мыши 5. Мы хотели бы выразить признательность Йоахим Кирш за щедрую поддержку научных и Анна Деген за работу в качестве наших мальчиком на побегушках во время съемок. Эта работа финансировалась Немецкого исследовательского фонда (Deutsche Forschungsgemeinschaft: Sonderforschungsbereich 488, Teilprojekt B7/B9) и Гейдельбергском университете (Совершенство кластер сотовой сети).
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| HBSS 10x | GIBCO | 14180 | ||
| Dissection tools | FST | various | ||
| L.M.P. agarose | Invitrogen | 15517-022 | ||
| Whatmann paper | Whatman Int. | 3030917 | ||
| Shortened firepolished pipettes | ||||
| DMEM | GIBCO | 41966 | ||
| FBS | GIBCO | 10270-106 | ||
| Pen Strep | GIBCO | 15140 | ||
| L-glutamine 100x | GIBCO | 25030 | ||
| Vibratome | Microm International GmbH | HM 650 V | ||
| Fluorescent microscope | Olympus | BX61WI | ||
| analySIS | Soft Imaging System | |||
| Millicell-CM inserts | Millipore | PICMORG 50 | ||
| 10 cm culture plates | Greiner Bio-One | 633171 | ||
| LOCTITE 406 | Henkel | 142580 | ||
| Razor blades | Thermo Fisher | none | ||
| Dissecting microscope | Nikon | SMZ800 | ||
| HEPES | Roth | 9105.2 | ||
| Glucose | Sigma | G7021 | ||
| x4 objective | Olympus | PL series | ||
| x10 objective | Olympus | UPLFL –PH series | ||
| Filter | Olympus | U-MNIBA2 | ||
| CCD camera | Soft Imaging System | SIS F-View II | ||
| Equipment for heated chamber | Leica | CTI-Controller 3700 and incubator S #11531171 |
Referências
- Tucker, K. L., Meyer, M., Barde, Y. A. Neurotrophins are required for nerve growth during development. Nat Neurosci. 4, 29-37 (2001).
- Brachmann, I., Jakubick, V. C., Shaked, M., Unsicker, K., Tucker, K. L. A simple slice culture system for the imaging of nerve development in embryonic mouse. Dev Dyn. 236, 3514-3523 (2007).
- Collingridge, G. L. The brain slice preparation: a tribute to the pioneer Henry McIlwain. Journal of neuroscience methods. 59, 5-9 (1995).
- Katz, L. C. Local circuitry of identified projection neurons in cat visual cortex brain slices. J Neurosci. 7, 1223-1249 (1987).
- Hotary, K. B., Landmesser, L. T., Tosney, K. W. Embryo slices. Methods Cell Biol. 51, 109-124 (1996).
