Em tempo real de imagens de leucotrienos B 4 Migração mediada por células e BLT1 Interações com β-arrestina
Summary
Este artigo descreve a metodologia para determinar a resposta quimiotática de leucócitos para ligantes específicos e identificar as interações entre os receptores da superfície celular e as proteínas citosólicas usando técnicas de imagem de células vivas.
Abstract
Receptores acoplados à proteína G (GPCRs) pertencem à família de proteínas transmembrana sete e mediar a transdução de sinais extracelulares de respostas intracelulares. GPCRs controle de diversas funções biológicas, como quimiotaxia, liberação de cálcio intracelular, regulação de genes de uma forma ligante dependente via heterotrimeric G-proteínas 1-2. Ligante de ligação induz uma série de mudanças conformacionais levando à ativação de heterotrimeric G-proteínas que modulam níveis de segundos mensageiros como a adenosina monofosfato cíclico (cAMP), o trifosfato de inositol (IP3) e glicerol diacyl (DG). Concomitante com a ativação da ligação ligante receptor também inicia uma série de eventos para atenuar o receptor de sinalização por meio de seqüestro de dessensibilização, e / ou internalização. O processo de dessensibilização dos GPCRs ocorre através de fosforilação do receptor de quinases da proteína G-receptor (GRKs) e subsequente ligação dos β-arrestinas 3. β-arrestinas são proteínas citosólicas e translocar para a membrana após a ativação GPCR, ligação aos receptores fosforilados (maioria dos casos) há, facilitando a internalização dos receptores 4-6.
Leucotrieno B 4 (LTB 4) é uma molécula de lipídio pró-inflamatórias derivadas de ácido araquidônico via e medeia suas ações através de GPCRs, LTB 4 receptor 1 (BLT1; um receptor de alta afinidade) e receptor LTB 4 2 (BLT2; um receptor de baixa afinidade ) 7-9. A LTB via 4-BLT1 foi mostrado para ser crítico em várias doenças inflamatórias, incluindo, artrite, asma e aterosclerose 10-17. O presente artigo descreve as metodologias desenvolvidas para monitorar LTB 4 induzida migração de leucócitos e as interações de BLT1 com β-arrestina e, a translocação do receptor em células vivas usando técnicas de microscopia de imagem 18-19.
Derivadas da medula óssea células dendríticas de camundongos C57BL / 6 foram isoladas e cultivadas como descrito anteriormente 20-21. Essas células foram testados em métodos de imagem ao vivo de células para demonstrar LTB 4 migração celular induzida. O BLT1 humano foi marcado com uma proteína fluorescente vermelha (BLT1-RFP) no C-terminal e β-arrestin1 marcados com proteína fluorescente verde (β-arr-GFP) e os plasmídeos transfectados em ambos os Rat basofílico Leukomia (RBL-2H3) linhas celulares 18-19. A cinética de interação entre essas proteínas e localização foram monitorados através de microscopia de vídeo ao vivo da célula. As metodologias no presente trabalho descrevem o uso de técnicas microscópicas para investigar as respostas funcionais do G receptores acoplados à proteína em células vivas. O presente artigo também descreve o uso de Metamorph software para quantificar a intensidade de fluorescência para determinar a cinética do receptor e interações proteína citosólica.
Protocol
Discussion
Imagens de células vivas é uma poderosa ferramenta para demonstrar a função e interações de proteínas específicas à medida que ocorrem em tempo real. Os métodos descritos neste manuscrito mostram claramente que a LTB 4 pode induzir a migração rápida de células dendríticas. Estes métodos não só ampliar os aspectos da função LTB 4 a diversos tipos de células, eles permitem que métodos semelhantes para ser aplicado a uma variedade de quimiocinas e outros testes de sua eficácia c…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
A pesquisa é suportada pelo National Institutes of Health bolsas AI-52381, CA138623 e Lung Cancer Research Board Kentucky e apoio institucional de James Graham Brown Cancer Center.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Cell lines: | ||||
| Rat Basophilic Leukomia Cell line (RBL-2H3) or HEK293 cells. | ATCC | CRL-2256 | ||
| Media: | ||||
| Delbecco’s modified Eagle’s Medium (DMEM) | Invitrogen | 11995 | ||
| Phenol red free RPMI or DMEM | Invitrogen | 11835-030 | ||
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen | 16000-044 | ||
| L-Glutamine (200 mM) | Invitrogen | 25030 | ||
| Penicillin-streptomycin (10000 U/mL) | Invitrogen | 15140 | ||
| Trypsin, 0.05% (1X) with EDTA 4Na, liquid | Invitrogen | 25300 | ||
| HEPES (1M) | Invitrogen | 15630 | ||
| Others: | ||||
| 35 mm sterile glass coverslip-bottomed Fluoro dishes (0.17 mm thick) (WillCo-dish) | WPI | FD35-100 | ||
| Sterile Gene Pulser Cuvette (0.4 cm electrode gap) (Bio-Rad) | Bio-Rad | 16552088 | ||
| Instruments/software: | ||||
| Gene Pulser II electroporater | Bio-Rad | |||
| TE-FM Epi-Fluorescence system attached to Nikon Inverted Microscope Eclipse TE300 | Nikon | |||
| Metamorph Software | Universal Imaging | |||
| Vertical Micro-pipette puller | Narishige International | |||
| Micro-Forge M-900 | Narishige International | |||
| Hadraulic Micromanipulator MO-188NE | Narishige International | |||
| Coarse Manual Manipulator, MN-188NE | Narishige International | |||
| cDNA constructs: | ||||
| cDNA of G-Protein coupled receptor tagged with red fluorescence protein at C-terminus (hBLT1-RFP) | Jala et al 2005 | |||
| cDNA of cytosolic protein tagged with GFP (β-arrestin1-GFP in present study). | Jala et al 2005 |
Referências
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