בידוד במבחנה הפעלת Caenorhabditis elegans זרע
Summary
פרוטוקול עבור בידוד והפעלת spermatids מן הזכר<em> ג elegans</em> מתוארת כאן. חיתוך הקצה האחורי של spermatids משחרר זכר. Spermatids יכול להיות מופעל על ידי תוספת של פרוטאז.
Abstract
זכרים הרמפרודיטים הם שתי צורות המינית נמצא באופן טבעי נמטודות C. elegans. זרע amoeboid מיוצרים על ידי שני גברים הרמפרודיטים. בשלב מוקדם יותר של gametogenesis, בתאי הנבט של הרמפרודיטים להתמיין מספר מוגבל של הזרע – בערך 300 – ו מאוחסנים "תיק" קטן שנקרא spermatheca. מאוחר יותר, הרמפרודיטים הרף לייצר ביציות 1. לעומת זאת, הזכרים מייצרים זרע רק לאורך הבגרות שלהם. הזכרים מייצרים זרע כל כך הרבה חשבונות עבור 50%> של תאים הכולל 2 מבוגרים אופיינית תולעת. לכן, בידוד זרע מהזכרים קל יותר מזה של הרמפרודיטים.
רק אחוז קטן של גברים נוצרות באופן טבעי, בשל הפער הלא ספונטני של כרומוזום X 3. מעבר הרמפרודיטים עם זכרים או בצורה נוחה יותר, את ההקדמה של מוטציות כדי להצמיח אותו (שכיחות גבוהה של זכרים) פנוטיפ כמה אסטרטגיות דרכו ניתן להעשיר את אוכלוסיית הגברים 3.
זכרים ניתן להבחין בקלות על ידי התבוננות 4 מורפולוגיה הזנב הרמפרודיטים. הזנב של הרמפרודיט הוא הצביע, ואילו זנבו של הזכר הוא מעוגל עם מבנים ההזדווגות.
חיתוך הזנב משחרר מספר עצום של spermatids מאוחסן בתוך מערכת הרבייה של הגבר. Dissection מבוצע תחת מיקרוסקופ סטריאופוני באמצעות מחטים מד 27. מאז spermatids אינם מחוברים פיזית עם כל שאר התאים, הלחץ ההידראולי מגרשת תוכן פנימי של הגוף הגברי, כולל spermatids 2.
הזכרים גזור ישירות על ירידה קטנה של "בינוני זרע". Spermatids רגישים שינוי ב-pH. לפיכך, HEPES, מתחם עם קיבולת חציצה טוב משמש בתקשורת הזרע. גלוקוז ומלחים אחרים מציגים בתקשורת זרע לסייע בשמירה על הלחץ האוסמוטי כדי לשמור על שלמות של הזרע.
פוסט meiotic בידול של spermatids לתוך זרע נקרא spermiogenesis או הפעלה הזרע. מנענע 5, ונלסון 6 בעבר הראו כי spermatids עגול יכול להיגרם להתמיין זרע על ידי הוספת מרכיבים שונים, כולל הפעלת Pronase E. כאן אנו מדגימים במבחנה spermiogenesis של C. elegans spermatids באמצעות Pronase E.
Spermiogenesis מוצלח הוא מראש הנדרשים לצורך פוריות ומכאן מוטנטים פגום spermiogenesis הם עקרים. מספר מוטציות עד כה הוכחו פגום במיוחד בתהליך spermiogenesis 7. חריגות שנמצאו במהלך בהפעלת במבחנה של הרומן SPE (spermatogenesis פגום) מוטנטים יעזור לנו לגלות שחקנים נוספים שהשתתפו באירוע.
Protocol
Discussion
בנוסף לניתוח מוטנטים SPE, פרוטוקול זה יש יישומים חשובים אחרים, כגון ניתוח מורפולוגיה הזרע עם ההזדקנות. Spermatids ו זרע בודד בפרוטוקול זה יכול לשמש בניסויים במורד אחרים כגון, immunostaining מסוג בר זרע מוטנטי 8, 9, תנועתיות הזרע על 10 שקופיות, מדידות פיזיולוגיות 9, 11,…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים סמואל וורד, דיאן ג שייקים גרגורי נלסון עבור חלוצי הטכניקה הזו. אנו מודים Pavan Kadandale ובריאן Geldziler עבור קטעי וידאו המציג זרע מופעל, חברי המעבדה Singson לדיונים מועיל; CGC עבור זנים ו-NIH על תמיכתם בנו באמצעות מענק (R01HD054681).
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Tuberculin syringe | Becton Dickinson | 309623 | Syringe: 1 ml, needle: 27G X ½ in |
|
| Pap pen | Zymed | 00-8888 | ||
| VWR VistaVision HistoBond Microscope Slides |
VWR International | 16004-406 | Dimension: 75X25X1mm |
|
| Cover glass | VWR International | 48366045 | ||
| Protease | Sigma | P-6911 |
Referências
- Kimble, J., Crittenden, S. L. Controls of germline stem cells, entry into meiosis, and the Sperm/Oocyte decision in Caenorhabditis elegans. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 23, 405-433 (2007).
- Lhernault, S. W., Roberts, T. M. . Methods in Cell Biology. , 273-301 (1995).
- Hodgkin, J., Horvitz, H., Brenner, S. Nondisjunction Mutants of the Nematode Caenorhabditis elegans. Genética. 91, 67-94 (1979).
- Altun, Z. F., Hall, D. H. Introduction to male C. elegans anatomy. WormAtlas. , (2008).
- Shakes, D., Ward, S. Initiation of spermiogenesis in C. elegans: a pharmacological and genetic analysis. Dev Biol. 134, 189-200 (1989).
- Nelson, G. A., Ward, S. Vesicle fusion, pseudopod extension and amoeboid motility are induced in nematode spermatids by the ionophore monensin. Cell. 19, 457-464 (1980).
- L’Hernault, S. W. The genetics and cell biology of spermatogenesis in the nematode C. elegans. Molecular and Cellular Endocrinology. 306, 59-65 (2009).
- Chatterjee, I., Richmond, A., Putiri, E., Shakes, D., Singson, A. The Caenorhabditis elegans spe-38 gene encodes a novel four-pass integral membrane protein required for sperm function at fertilization. Development. 132, 2795-2808 (2005).
- Xu, X., Sternberg, P. A C. elegans sperm TRP protein required for sperm-egg interactions during fertilization. Cell. 114, 285-297 (2003).
- Nelson, G., Roberts, T., Ward, S. Caenorhabditis elegans spermatozoan locomotion: amoeboid movement with almost no actin. J Cell Biol. 92, 121-131 (1982).
- Machaca, K., DeFelice, L. J., L’Hernault, S. W. A novel chloride channel localizes to Caenorhabditis elegans spermatids and chloride channel blockers induce spermatid differentiation. Dev Biol. 176, 1-16 (1996).
- LaMunyon, C., Ward, S. Assessing the viability of mutant and manipulated sperm by artificial insemination of Caenorhabditis elegans. Genética. 138, 689-692 (1994).
