Whole Cell-הקלטה של סידן סידן שחרור פעילה (CRAC) זרמים האדם לימפוציטים-T
Summary
אנו מספקים פרוטוקול צעד אחר צעד עבור הקלטת כל תא תיקון מהדק של סידן סידן שחרור פעילה (CRAC) זרמים היקפי mononuclear תאים שמקורם בדם אנושי לימפוציטים-T.
Abstract
ב לימפוציטים מסוג T, דלדול של Ca 2 + מ תאיים Ca 2 + חנות מוביל ההפעלה של plasmalemmal Ca 2 ערוצים +, שנקרא שחרור המופעל סידן סידן (CRAC) ערוצים. ערוצי CRAC לשחק תפקיד חשוב בוויסות של התפשטות תאים T ו ביטוי גנים. חריגה פונקציה CRAC ערוץ בתאי T נקשר חמורה כשל חיסוני ומחלות אוטואימוניות וכן בשילוב 1, 2. לימוד פונקציה ערוץ CRAC בבני אדם בתאי T עשויה לחשוף המנגנונים המולקולריים חדש המסדיר התגובות החיסוניות נורמלי לפענח את הגורמים מחלות אנושיות בנושא. הקלטות של זרמים אלקטרו קרום לספק הערכה מדויקת ביותר של נכסים ערוץ פונקציונלי ורגולציה שלהם. הערכה של זרמים אלקטרו CRAC ערוץ Jurkat בתאי T, לוקמיה האדם T שורת תאים, בוצעה לראשונה יותר מאשר לפני 20 שנה 3, לעומת זאת, מדידות CRAC הנוכחי נורמלי בתאי T אנושיים נותר משימה מאתגרת. הקשיים ברישום זרמי CRAC ערוץ נורמלי בתאי T הן מורכב על ידי העובדה דם הנגזרות לימפוציטים מסוג T הם הרבה יותר קטנים בגודל מאשר תאים Jurkat T, ולכן אנדוגני כל תא זרמים CRAC נמוכים מאוד משרעת. הנה, אנחנו נותנים הליך צעד אחר צעד שאנחנו משתמשים באופן שגרתי להקליט את Ca 2 + או Na + זרמים דרך ערוצים CRAC ב נחים אדם בתאי T מבודדים מהדם ההיקפי של מתנדבים בריאים. השיטה המתוארת כאן אומצה מהנהלים המשמש הקלטה הזרמים CRAC בתאי T Jurkat והופעל אדם בתאי T 4-8.
Protocol
Discussion
החקירה של זרמים אלקטרו CRAC ב נחים אדם בתאי T היא משימה מאתגרת כי משרעת אנדוגני הנוכחית CRAC בתאים אלה הוא קטן בשל גודל תאים קטנים (בקוטר מנוחה האדם T התא בטווח של 5-8 מיקרומטר). כאן, אנו מציגים הליך צעד אחר צעד באופן מהימן שיא זרמים CRAC בבני אדם לימפוציטים T מנוחה מבודדים תאים ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנחנו אסירי תודה על המחלקה לפיזיולוגיה ממברנה לביולוגיה, אוניברסיטת קליפורניה דייויס לספק לנו מתקני אווירה מצוינת עבור המחקרים של תעלות יונים.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| RosetteSep Human T Cell Enrichment Cocktail | StemCell Technologies, Vancouver, BC, Canada | 15061 | ||
| RosetteSep Density Medium | StemCell Technologies | 15705 | ||
| RPMI-in 1640 medium w/glutamine/HEPES | Fisher, Waltham, MA | SH3025501 | ||
| Fetal Calf Serum | Omega Scientific, Tarzana, CA | FB-01 | ||
| GlutaMAX-I (100X solution) | Invitrogen, Carlsbad, CA | 35050 | ||
| RPMI 1640 vitamin solution (100X) | Sigma-Aldrich | 7256 | ||
| 1640 amino acids solution (50X) | Sigma-Aldrich | R7131 | ||
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | S8636 | ||
| β-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M7522 | ||
| Inositol trisphosphate | Sigma-Aldrich | 19766 | ||
| BAPTA | Sigma-Aldrich | A4926 | ||
| Poly-L-Lysine Hydrobromide | Sigma-Aldrich | P2636 | ||
| Lanthanum Chloride | Sigma-Aldrich | 262072 | ||
| Thapsigargin | Calbiochem | 586005 | ||
| Sylgard 184 Silicon Elastomer Kit | Dow Corning, Midland, MI | 3097358-1004 | ||
| HIPEC R6101 Semiconductor Protective Coating | Dow Corning, Midland, MI | |||
| 63-500 Series High-Performance Vibration Isolation Lab Table | Technical Manufacturing, Peabody, MA | 63-540 | ||
| EPC 10 patch clamp amplifier with headstage | HEKA Instruments, Bellmore, NY | |||
| Micromanipulator | Sutter Instrument, Novato, CA | MP-285 | ||
| Olympus 1X71 Inverted microscope with 40x oil immersion objective | Olympus America, Center Valley, PA | 1X71 | ||
| Windows Computer | Dell | |||
| Pulse software | HEKA Instruments | |||
| Origin Scientific Graphing and Analysis Software | OriginLab, Northampton, MA | |||
| Patch pipette puller | Sutter Instrument | P-97 | ||
| Borosilicate glass with filament (O.D.: 1.5mm and I.D.: 1.10mm | Sutter Instrument | BF150-110-7.5 | ||
| Narashige’s Microforge | Tritech Research, Los Angeles, CA | MF-830 | ||
| Silicon O-rings | McMASTER-CARR, Santa Fe Springs, CA | 111 S70 | ||
| Coverslips 25 mm | Fisher Scientific | 12-545-102 25 mm 25CIR.-1 |
Referências
- Parekh, A. B. Store-operated CRAC channels: function in health and disease. Nat Rev Drug Discov. 9, 399-410 (2010).
- Feske, S. CRAC channelopathies. Pflugers Arch. , (2010).
- Lewis, R. S., Cahalan, . Mitogen-induced oscillations of cytosolic Ca2+ and transmembrane Ca2+ current in human leukemic T cells. Cell Regul. 1, 99-112 (1989).
- Zweifach, A., Lewis, R. S. Rapid inactivation of depletion-activated calcium current (ICRAC) due to local calcium feedback. J Gen Physiol. 105, 209-226 (1995).
- Zweifach, A., Lewis, R. S. Slow calcium-dependent inactivation of depletion-activated calcium current. Store-dependent and -independent mechanisms. J Biol Chem. 270, 14445-1451 (1995).
- Zweifach, A., Lewis, R. S. Calcium-dependent potentiation of store-operated calcium channels in T lymphocytes. J Gen Physiol. 107, 597-610 (1996).
- Prakriya, M., Lewis, R. S. Separation and characterization of currents through store-operated CRAC channels and Mg2+-inhibited cation (MIC) channels. J Gen Physiol. 119, 487-507 (2002).
- Fomina, A. F., Fanger, C. M., Kozak, J. A., Cahalan, . Single channel properties and regulated expression of Ca(2+) release-activated Ca(2+) (CRAC) channels in human T cells. J Cell Biol. 150, 1435-1444 (2000).
- Sakmann, B., Neher, E. . Single-Channel Recording. , (1995).
- Neher, E. Correction for liquid junction potentials in patch clamp experiments. Methods Enzymol. 207, 123-1231 (1992).
