Whole-Cell Registrazione del calcio Release-Activated di calcio (CRAC) Correnti in Human Linfociti T
Summary
Forniamo un passo-passo protocollo per la cellula intera registrazione patch clamp di calcio Release-Activated di calcio (CRAC) correnti in cellule mononucleate del sangue periferico derivati linfociti T umani.
Abstract
Nei linfociti T, l'esaurimento di Ca 2 + dal intracellulare Ca 2 + negozio porta all'attivazione di plasmalemmal Ca + 2 canali, chiamati Calcio Release-Activated di calcio (CRAC) canali. Canali CRAC un ruolo molto importante nella regolazione della proliferazione delle cellule T e l'espressione genica. Anormale funzione del canale CRAC nelle cellule T è stato collegato a gravi malattie autoimmuni immunodeficienza combinata e 1, 2. Studiare la funzione CRAC canale in cellule T possono scoprire nuovi meccanismi molecolari che regolano le normali risposte immunitarie e svelare le cause di malattie umane correlate. Le registrazioni elettrofisiologiche delle correnti di membrana forniscono la valutazione più accurata delle proprietà del canale funzionale e la loro regolamentazione. Valutazione elettrofisiologica CRAC correnti di canale in cellule Jurkat T, un essere umano linea di leucemia a cellule T, è stata eseguita più di 20 anni fa 3, tuttavia, le misurazioni CRAC corrente in normali cellule T umano rimane un compito impegnativo. Le difficoltà di registrazione dei canali CRAC correnti in normali cellule T sono aggravate dal fatto che i derivati dal sangue i linfociti T sono molto più piccoli nelle dimensioni di cellule Jurkat T e, di conseguenza, l'intero endogeno delle cellule correnti CRAC sono molto bassi in ampiezza. Qui, diamo uno step-by-step procedura che abitualmente utilizzano per registrare il Ca 2 + o Na + correnti attraverso canali CRAC a riposo cellule T isolate dal sangue periferico di donatori sani. Il metodo qui descritto è stato adottato dalle procedure utilizzate per la registrazione delle correnti CRAC in cellule Jurkat T e cellule T attivate umane 4-8.
Protocol
Discussion
Le indagini elettrofisiologiche delle correnti CRAC a riposo cellule T è un compito impegnativo perché la endogeno ampiezza CRAC corrente in queste cellule è di piccole dimensioni a causa delle dimensioni piccole cellule (il riposo umano diametro delle cellule T è nel range di 5-8 micron). Qui vi presentiamo uno step-by-step procedura affidabile per registrare le correnti CRAC a riposo linfociti T umane isolate da cellule mononucleari del sangue periferico. Questa tecnologia ci permette di studiare la fisiologia e l…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Siamo grati al Dipartimento di Fisiologia e membrana Biologia, Università di California Davis per averci fornito servizi e un ambiente eccellente per lo studio dei canali ionici.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| RosetteSep Human T Cell Enrichment Cocktail | StemCell Technologies, Vancouver, BC, Canada | 15061 | ||
| RosetteSep Density Medium | StemCell Technologies | 15705 | ||
| RPMI-in 1640 medium w/glutamine/HEPES | Fisher, Waltham, MA | SH3025501 | ||
| Fetal Calf Serum | Omega Scientific, Tarzana, CA | FB-01 | ||
| GlutaMAX-I (100X solution) | Invitrogen, Carlsbad, CA | 35050 | ||
| RPMI 1640 vitamin solution (100X) | Sigma-Aldrich | 7256 | ||
| 1640 amino acids solution (50X) | Sigma-Aldrich | R7131 | ||
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | S8636 | ||
| β-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M7522 | ||
| Inositol trisphosphate | Sigma-Aldrich | 19766 | ||
| BAPTA | Sigma-Aldrich | A4926 | ||
| Poly-L-Lysine Hydrobromide | Sigma-Aldrich | P2636 | ||
| Lanthanum Chloride | Sigma-Aldrich | 262072 | ||
| Thapsigargin | Calbiochem | 586005 | ||
| Sylgard 184 Silicon Elastomer Kit | Dow Corning, Midland, MI | 3097358-1004 | ||
| HIPEC R6101 Semiconductor Protective Coating | Dow Corning, Midland, MI | |||
| 63-500 Series High-Performance Vibration Isolation Lab Table | Technical Manufacturing, Peabody, MA | 63-540 | ||
| EPC 10 patch clamp amplifier with headstage | HEKA Instruments, Bellmore, NY | |||
| Micromanipulator | Sutter Instrument, Novato, CA | MP-285 | ||
| Olympus 1X71 Inverted microscope with 40x oil immersion objective | Olympus America, Center Valley, PA | 1X71 | ||
| Windows Computer | Dell | |||
| Pulse software | HEKA Instruments | |||
| Origin Scientific Graphing and Analysis Software | OriginLab, Northampton, MA | |||
| Patch pipette puller | Sutter Instrument | P-97 | ||
| Borosilicate glass with filament (O.D.: 1.5mm and I.D.: 1.10mm | Sutter Instrument | BF150-110-7.5 | ||
| Narashige’s Microforge | Tritech Research, Los Angeles, CA | MF-830 | ||
| Silicon O-rings | McMASTER-CARR, Santa Fe Springs, CA | 111 S70 | ||
| Coverslips 25 mm | Fisher Scientific | 12-545-102 25 mm 25CIR.-1 |
Referências
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- Lewis, R. S., Cahalan, . Mitogen-induced oscillations of cytosolic Ca2+ and transmembrane Ca2+ current in human leukemic T cells. Cell Regul. 1, 99-112 (1989).
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