인간의 T Lymphocytes에서 칼슘 출시가 활성화된 칼슘의 전체 세포 기록 (CRAC) 해류
Summary
우리는 칼슘 출시가 활성화된 칼슘의 전체 세포 패치 클램프 녹음 (CRAC) 말초 혈액 mononuclear 세포 – 파생 인간 T의 lymphocytes의 전류에 대한 단계별 절차를 제공합니다.
Abstract
T lymphocytes 년, CA 2 고갈 + 세포내 칼슘 2 + 저장소, plasmalemmal 칼슘 2 활성화에 + 채널을 리드 칼슘 출시가 활성화된 칼슘 (CRAC) 채널을했다. CRAC 채널은 T 세포 증식 및 유전자 발현의 조절에 중요한 역할을한다. T 세포의 비정상적인 CRAC 채널 기능이 심한 결합 면역 결핍과 면역 질환 1, 2에 연결되어 있습니다. 인간 T 세포의 CRAC 채널 기능을 공부하는 것은 정상적인 면역 반응을 조절 새로운 분자 메커니즘을 발견하고 관련 인간 질병의 원인을 풀다 수 있습니다. 멤브레인 전류의 Electrophysiological 녹음 기능 채널 특성과 규제의 가장 정확한 평가를 제공합니다. Jurkat T 세포, 인간의 백혈병 T 세포 라인에 CRAC 채널 전류의 Electrophysiological 평가는 처음 3 전 20 년 이상 수행했다, 그러나 정상적인 인간의 T 세포에 CRAC 전류 측정이 어려운 과제 남아있다. 정상적인 T 세포의 CRAC 채널 전류를 기록의 어려움은 혈액 파생 T의 lymphocytes가 Jurkat T 세포보다 크기가 훨씬 작고, 따라서 내생 전체 세포 CRAC 전류가 진폭 매우 낮게있다는 사실에 의해 혼합 수 있습니다. 여기, 우리가 정기적으로 칼슘 2를 기록하는 데 사용하는 + 나 + 나 건강한 자원 봉사자의 말초 혈액에서 분리된 인간의 T 세포를 휴식에 CRAC 채널을 통해 전류. 단계별 절차를 제공 방법은 여기에 설명된 Jurkat T 세포에서 CRAC 전류를 기록하고 인간의 T 세포 4-8을 활성화에 사용되는 절차에서 채택되었습니다.
Protocol
Discussion
이러한 세포의 내생 CRAC 현재 진폭이 작은 셀 크기 (쉬고 인간 T 세포의 직경은 5-8 μm의 범위에있는)에 의한 소형이기 때문에 인간의 T 세포를 휴식에 CRAC 전류 electrophysiological 조사 어려운 작업입니다. 여기에서 우리는 확실하게 주변 혈액 mononuclear 세포로부터 격리 쉬고있는 인간의 T lymphocytes에 CRAC 전류를 기록하기위한 단계별 절차를 제시한다. 이 기술은 우리가 더 나은 정상 및 병적인 면역 세?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 시설과 이온 채널의 연구에 대한 훌륭한 환경으로 우리를 제공 생리학 및 분리막 생물, 캘리포니아 데이비스 대학의학과에 감사하고 있습니다.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| RosetteSep Human T Cell Enrichment Cocktail | StemCell Technologies, Vancouver, BC, Canada | 15061 | ||
| RosetteSep Density Medium | StemCell Technologies | 15705 | ||
| RPMI-in 1640 medium w/glutamine/HEPES | Fisher, Waltham, MA | SH3025501 | ||
| Fetal Calf Serum | Omega Scientific, Tarzana, CA | FB-01 | ||
| GlutaMAX-I (100X solution) | Invitrogen, Carlsbad, CA | 35050 | ||
| RPMI 1640 vitamin solution (100X) | Sigma-Aldrich | 7256 | ||
| 1640 amino acids solution (50X) | Sigma-Aldrich | R7131 | ||
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | S8636 | ||
| β-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M7522 | ||
| Inositol trisphosphate | Sigma-Aldrich | 19766 | ||
| BAPTA | Sigma-Aldrich | A4926 | ||
| Poly-L-Lysine Hydrobromide | Sigma-Aldrich | P2636 | ||
| Lanthanum Chloride | Sigma-Aldrich | 262072 | ||
| Thapsigargin | Calbiochem | 586005 | ||
| Sylgard 184 Silicon Elastomer Kit | Dow Corning, Midland, MI | 3097358-1004 | ||
| HIPEC R6101 Semiconductor Protective Coating | Dow Corning, Midland, MI | |||
| 63-500 Series High-Performance Vibration Isolation Lab Table | Technical Manufacturing, Peabody, MA | 63-540 | ||
| EPC 10 patch clamp amplifier with headstage | HEKA Instruments, Bellmore, NY | |||
| Micromanipulator | Sutter Instrument, Novato, CA | MP-285 | ||
| Olympus 1X71 Inverted microscope with 40x oil immersion objective | Olympus America, Center Valley, PA | 1X71 | ||
| Windows Computer | Dell | |||
| Pulse software | HEKA Instruments | |||
| Origin Scientific Graphing and Analysis Software | OriginLab, Northampton, MA | |||
| Patch pipette puller | Sutter Instrument | P-97 | ||
| Borosilicate glass with filament (O.D.: 1.5mm and I.D.: 1.10mm | Sutter Instrument | BF150-110-7.5 | ||
| Narashige’s Microforge | Tritech Research, Los Angeles, CA | MF-830 | ||
| Silicon O-rings | McMASTER-CARR, Santa Fe Springs, CA | 111 S70 | ||
| Coverslips 25 mm | Fisher Scientific | 12-545-102 25 mm 25CIR.-1 |
Referências
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