O presente artigo descreve um protocolo rápido de forma eficiente isolamento de células mononucleares a partir de tecidos do cérebro e da medula espinhal que pode ser efetivamente utilizado para análises de citometria de fluxo.
Abstract
Isolamento de células do sistema imunológico que se infiltrar no sistema nervoso central (SNC) durante a infecção, trauma auto-imunidade, ou neurodegeneração, é muitas vezes necessária para definir seu fenótipo e funções efetoras. Abordagens histoquímica são instrumentais para determinar a localização das células infiltrando e analisar o SNC patologia associada. No entanto, in-situ histoquímica e técnicas de coloração de imunofluorescência são limitados pelo número de anticorpos que podem ser usados em uma única vez para caracterizar os subtipos de células imunes em um tecido particular. Portanto, as abordagens histológicas em conjunto com imuno-fenotipagem por citometria de fluxo são fundamentais para caracterizar completamente a composição do CNS infiltração local. Este protocolo é baseado na separação do CNS suspensões celulares mais descontínua Percoll gradientes. O presente artigo descreve um protocolo rápido de forma eficiente isolamento de células mononucleares a partir de tecidos do cérebro e da medula espinhal que pode ser efetivamente utilizado para a identificação de várias populações de células imunes em uma única amostra por citometria de fluxo.
Protocol
Preparação de reagentes Prepare estoque isotônica Percoll (SIP), 4 ml por cérebro, através da mistura de 9 partes de Percoll com uma parte de HBSS 10X sem Ca + + e Mg + +. Prepare SIP menos 70% em 1X HBSS sem Ca + + e Mg + +, 2 ml por cérebro dispensado em um tubo de polipropileno 15 ml. Nota: Recomenda-se que Percoll deve ser usado em temperatura ambiente, se usado frio, as células tendem a aglutinar-se e separação celular é …
Discussion
Análises de marcadores de superfície celular no SNC leucócitos a partir de tecidos de rato normal e inflamado tem sido utilizado por várias décadas 1-3. Protocolos de isolamento são baseados na separação de microglia e leucócitos por 4 centrifugação densidade. Aqui nós descrevemos um método rápido e eficaz de isolar CNS leucócitos usando gradientes descontínuos de Percoll. Após o isolamento de células, coloração com anticorpos diversos, tais como, mas não se limitando a-CD45, C…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado pela National Multiple Sclerosis Society (TA 3021-A1 / T para AEC) e da Universidade do Texas em San Antonio.
Materials
Tissue homogenization and Gradients
Percoll (Amersham)
10X Hanks’ Balanced Salt Solution, without Calcium and Magnesium (Gibco)
RPMI Medium 1640, without phenol red (Gibco)
7-ml or 15-ml Dounce Tissue Grinders (VWR)
Flow cytometry
Cell Staining Buffer (Biolegend)
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block), BD Pharmingen
Pino, P. A., Cardona, A. E. Isolation of Brain and Spinal Cord Mononuclear Cells Using Percoll Gradients. J. Vis. Exp. (48), e2348, doi:10.3791/2348 (2011).