Las larvas de pez cebra representan el sistema de vertebrados primer modelo que permite la grabación simultánea de patch clamp de una neurona motora espinal y el objetivo del músculo esquelético. Este video muestra los métodos microscópicos para identificar un CaP segmentaria neurona motora y las células diana muscular, así como las metodologías para la grabación de cada tipo de célula.
Las larvas de pez cebra representan el sistema de vertebrados primer modelo que permite la grabación simultánea de patch clamp de una neurona motora espinal y los músculos objetivo. Esto es una consecuencia directa de la accesibilidad a ambos tipos de células y su capacidad para distinguir visualmente el único de la PAC segmental neuronal motor sobre la base de la morfología y localización. Este video muestra los métodos microscópicos para identificar un CaP neurona motora y las células diana muscular, así como las metodologías para la grabación de cada tipo de célula. Identificación de la PAC neurona motora tipo se confirma mediante la cumplimentación tinte sea o por las características biofísicas, como forma de onda del potencial de acción y resistencia de entrada de la célula. Neurona motora grabaciones habitualmente duran una hora que permita a largo plazo a partir de múltiples grabaciones de las diferentes células del músculo blanco. El control sobre el patrón de activación neuronal motor permite realizar mediciones de la frecuencia de la dependencia de la transmisión sináptica en la unión neuromuscular. Debido al gran tamaño cuántico y el bajo nivel de ruido proporciona sujeción total voltaje de la célula, todos los eventos unitarios se pueden resolver en el músculo. Esta característica permite el estudio de las propiedades básicas sináptica como propiedades de liberación, reciclaje de vesículas, así como la depresión sináptica y la facilitación. Las ventajas que ofrece esta preparación en vivo eclipse de anteriores modelos de sistemas neuromuscular en la que estudiaron las neuronas motoras son generalmente estimuladas por electrodos extracelulares y los músculos son demasiado grandes para la abrazadera de toda mancha de la célula. La preparación del pez cebra puede ser objeto de combinar el análisis electrofisiológico con una amplia gama de enfoques, incluyendo las líneas transgénicas, caída morfolino, la intervención farmacológica y de imágenes in vivo. Estos enfoques, junto con el creciente número de modelos de enfermedad neuromuscular proporcionada por líneas mutantes de pez cebra, abrir la puerta a una nueva comprensión de los derechos humanos trastornos neuromusculares.
Hemos estado utilizando el pez cebra grabaciones pares (Wen y Brehm, 2005), principalmente para estudiar los procesos de liberación de la vesícula y el reciclaje durante la estimulación de alta frecuencia. Este proceso se interrumpe en los mutantes de la motilidad en el que la transmisión sináptica normal se ve comprometida debido a mutaciones puntuales en los principales componentes sináptica. Por ejemplo, las mutaciones que alteran los agregados postsináptica de los receptores (Ono et al., 2001, 2002, 2004) y la síntesis del transmisor de pre-sináptica (Wang et al., 2008) como resultado de las Naciones Unidas coordinado natación. Grabaciones de pares de proporcionar la información que puede identificar la fuente del defecto funcional, vinculando así el comportamiento, genética y fisiología. Ahora debería ser posible diseccionar los procesos subyacentes a la transmisión sináptica a través de la expresión transitoria de la PAC motor neuronas usando promotores juiciosa. De esta manera genes dominantes negativos o mutados pueden ser expresados específicamente en las neuronas y se determinó tanto las consecuencias del comportamiento y electrofisiológicos. La ventaja adicional que ofrece la configuración de célula entera permite la diálisis de la soma de la PAC con los agentes que potencialmente pueden alterar reciclaje de vesículas, como las toxinas clostridiales y los buffers de calcio. Debido a la corta distancia entre el soma y el músculo, la difusión debe ocurrir dentro del marco de tiempo de las grabaciones. El potencial de esta preparación ha comenzado a ser explotado. La transparencia de los peces en este lugar la edad y superficial de las sinapsis también facilita el uso de herramientas ópticas (Fletcho y O'Malley, 1997; Fletcho y Higashijima, 2004). Hemos tenido mucho éxito en la medición de endo y exocitosis en los peces que viven con tintes FM y los indicadores genéticos, como Synaptophluorin (Li et al., 2003). Además, las toxinas conjugado fluorescente se puede utilizar para etiquetar las proteínas sinápticas de imágenes de peces vivos (Ibáñez-Tallon et al., 2004). Dada la simplicidad de esta preparación es una gran promesa para el futuro estudio.
The authors have nothing to disclose.
Financiado por el NIH (NS-18205).
Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
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Pneumatic transducer tester | Fluke Biomedical Instruments | DPM1B | ||
0.002 x 3 inch tungsten rod | A-M Systems Inc | 715000 | ||
Sylgard 184 Elastomer | Dow Corning Corp. | The thickness of application will affect the DIC optics |