Larver zebrafisk representerar det första systemet ryggradsdjur modell för att möjliggöra samtidig inspelning patch clamp från en spinal motor-neuron och mål skelettmuskulaturen. Denna video visar den mikroskopiska metoder som används för att identifiera en segmentell Cap motor-neuron och mål muskelceller samt metoder för inspelning från varje celltyp.
Larver zebrafisk representerar det första systemet ryggradsdjur modell för att möjliggöra samtidig inspelning patch clamp från en spinal motor-neuron och utvalda muskeln. Detta är en direkt följd av tillgängligheten till både celltyper och förmåga att visuellt urskilja enskild segmentell Cap motor-neuron på basis av morfologi och plats. Denna video visar den mikroskopiska metoder som används för att identifiera en Cap motor-neuron och mål muskelceller samt metoder för inspelning från varje celltyp. Identifikation av den gemensamma jordbrukspolitiken motor-neuron typ bekräftas av antingen färgämne fyllning eller av biofysiska funktioner som aktionspotentialens vågform och cell-ingång motstånd. Motor-neuron inspelningar rutinmässigt pågå i en timme tillåter långa inspelningar från flera olika celler utvalda muskeln. Kontroll över motor-neuron bränning mönster möjliggör mätningar av frekvens-beroende av synaptiska transmissionen i den neuromuskulära förbindelsen. På grund av ett stort quantal storlek och låg ljudnivå från hela cellspänning klämma, kan alla av den administrativa händelser lösas i muskeln. Denna funktion medger studie av grundläggande synaptiska egenskaper såsom frisättning, vesikler återvinning samt synaptisk depression och underlättande. Fördelarna med detta in vivo förberedelse solförmörkelse tidigare neuromuskulära modellsystem studeras där motor-nervceller är ofta stimuleras av extracellulära elektroder och musklerna är för stora för hela cell patch clamp. Den zebrafisk Beredningen är mottaglig att kombinera elektrofysiologiska analys med ett brett spektrum av metoder, bland annat transgena linjer, morpholino ÖVERVÄLDIGANDE, farmakologisk behandling och in vivo imaging. Dessa metoder, tillsammans med det växande antalet neuromuskulär sjukdom modeller som muterade rader av zebrafisk, öppna dörren för ny förståelse av människans neuromuskulära sjukdomar.
Vi har använt sebrafisk parade inspelningar (Wen och Brehm, 2005) främst för att studera de processer av vesikler utsläpp och återvinning vid högfrekvent stimulering. Denna process avbryts i motilitet mutanter där normal synaptisk transmission är nedsatt på grund av punktmutationer i viktiga synaptisk komponenter. Till exempel, mutationer som stör postsynaptiska receptorn aggregat (Ono et al., 2001, 2002, 2004) och syntes av presynaptiska sändare (Wang et al., 2008) resultera i FN-samordnade simning. Kopplade inspelningar lämna de uppgifter som kan lokalisera källan till den funktionella fel, och därmed knyta beteende, genetik och fysiologi. Det bör nu vara möjligt att ytterligare dissekera de processer som ligger bakom synaptisk överföring med hjälp av övergående uttryck i den gemensamma jordbrukspolitiken motor-nervceller med hjälp av kloka initiativtagare. På detta sätt dominerande negativa eller muterade gener specifikt kan uttryckas i dessa nervceller och både beteende-och elektrofysiologiska effekter fastställas. Den ytterligare fördel som erbjuds av hela cellen konfiguration tillåter dialys av den gemensamma jordbrukspolitiken Soma med medel som potentiellt kan förändra vesikler återvinning, exempelvis clostridier gifter och buffertar kalcium. På grund av det korta avståndet mellan soma och muskler, bör spridningen ske såväl inom tidsramen av inspelningar. Potentialen för detta preparat har bara börjat utnyttjas. Öppenheten i fisken i denna ålder och ytliga placering av synapser underlättar också användningen av optiska hjälpmedel (Fetcho och O'Malley, 1997; Fetcho och Higashijima, 2004). Vi har varit mycket framgångsrika med att mäta av endo-och exocytos i levande fisk med hjälp av FM-färger och genetiska indikatorer såsom Synaptophluorin (Li et al., 2003). Dessutom kan fluorescerande konjugerade toxiner skall användas vid märkning synaptiska proteiner för avbildning av levande fisk (Ibanez-Tallon et al., 2004). Med tanke på enkelheten i denna beredning det är mycket lovande för framtida studier.
The authors have nothing to disclose.
Finansieras av NIH (NS-18.205).
Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
Pneumatic transducer tester | Fluke Biomedical Instruments | DPM1B | ||
0.002 x 3 inch tungsten rod | A-M Systems Inc | 715000 | ||
Sylgard 184 Elastomer | Dow Corning Corp. | The thickness of application will affect the DIC optics |