Alphavirus Transducing सिस्टम: मच्छर वैक्टर में संक्रमण Visualizing के लिए उपकरण

Summary

Alphavirus transducing प्रणालियों का उपयोग करने के लिए इन विट्रो में और वयस्क मच्छरों में फ्लोरोसेंट संवाददाताओं व्यक्त करने के लिए तरीके का वर्णन कर रहे हैं. इस तकनीक के एवज में या एक पत्रकार के अलावा ब्याज की किसी भी प्रोटीन व्यक्त करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है.

Abstract

Alphavirus transducing systems (ATSs) are important tools for expressing genes of interest (GOI) during infection. ATSs are derived from cDNA clones of mosquito-borne RNA viruses (genus Alphavirus; family Togaviridae). The Alphavirus genus contains about 30 different mosquito-borne virus species. Alphaviruses are enveloped viruses and contain single-stranded RNA genomes (~11.7 Kb). Alphaviruses transcribe a subgenomic mRNA that encodes the structural proteins of the virus required for encapsidation of the genome and maturation of the virus. Alphaviruses are usually highly lytic in vertebrate cells, but persistently infect susceptible mosquito cells with minimal cytopathology. These attributes make them excellent tools for gene expression in mosquito vectors. The most common ATSs in use are derived from Sindbis virus (SINV). The broad species tropism of SINV allows for infection of insect, avian, and mammalian cells8. However, ATSs have been derived from other alphaviruses as well^9,10,20. Foreign gene expression is made possible by the insertion of an additional viral subgenomic RNA initiation site or promoter. ATSs in which an exogenous gene sequence is positioned 5′ to the viral structural genes is used for stable protein expression in insects. ATSs, in which a gene sequence is positioned 3′ to the structural genes, is used to trigger RNAi and silence expression of that gene in the insect.

ATSs have proven to be valuable tools for understanding vector-pathogen interactions, molecular details of viral replication and maintenance infectious cycles^3,4,11,19,21. In particular, the expression of fluorescent and bioluminescent reporters has been instrumental tracking the viral infection in the vector and virus transmission^5,14-16,18. Additionally, the vector immune response has been described using two strains of SINV engineered to express GFP^2,9.

Here, we present a method for the production of SINV containing a fluorescent reporter (GFP) from the cDNA infectious clone. Infectious, full-length RNA is transcribed from the linearized cDNA clone. Infectious RNA is introduced into permissive target cells by electroporation. Transfected cells generate infectious virus particles expressing the GOI. Harvested virus is used to infect mosquitoes, as described here, or other host species (not shown herein). Vector competence is assessed by detecting fluorescence outside the midgut or by monitoring virus transmission⁷. Use of a fluorescent reporter as the GOI allows for convenient estimation of virus spread throughout a cell culture, for determination of rate of infection, dissemination in exposed mosquitoes, virus transmission from the mosquito and provides a rapid gauge of vector competence.

Protocol

निम्न उत्पादन और एटीएस के एक का उपयोग Sindbis MRE16 वायरस पर आधारित प्रोटोकॉल के लिए लिखा है. एटीएस मच्छर वेक्टर एडीज aegypti में GFP व्यक्त करने के लिए डिज़ाइन किया गया है. alphaviruses के एक नंबर (Sindbis वायरस, चिकनगुनिया वायरस, O'nyong nyong वायरस, पश्चिमी इक्वाइन इन्सेफेलाइटिस वायरस) के सीडीएनए संक्रामक क्लोनों वर्तमान में उपलब्ध हैं कि एटीएस है (तालिका 1) के रूप में डिजाइन किया गया है. सर्वोत्तम परिणामों के लिए प्लास्मिड डीएनए ज़रूर सक्षम (Stratagene / Agilent टेक्नोलॉजीज) बैक्टीरिया को अवांछित पुनर्संयोजन और वायरल सीडीएनए के नुकसान से बचने के रूप में ऐसे बैक्टीरिया में परिलक्षित होता है. सभी संक्रामक क्लोन plasmids अपवाह प्रतिलेखन के लिए अंत पूर्ण लंबाई जीनोमिक शाही सेना का प्रतिलेखन और 3 पर एक अद्वितीय प्रतिबंध endonuclease के लिए वायरल सीडीएनए के अंत जीवाणुभोजी T7 या तत्काल 5 SP6 प्रमोटर है. प्रत्येक एटीएस के लिए, उपयोगकर्ताओं को उचित जीवाणुभोजी डीएनए निर्भर शाही सेना पोलीमरेज़ और वायरल शाही सेना जीनोम के इन विट्रो प्रतिलेखन के लिए अद्वितीय प्रतिबंध endonuclease का उपयोग करना चाहिए. 1. सीडीएनए क्लोन से संक्रामक शाही सेना की पीढ़ी. XhoI प्रतिबंध एंजाइम की 20 इकाइयों के साथ एक 100 μL प्रतिक्रिया में संक्रामक प्लाज्मिड (p5'dsMRE16 / GFP) के क्लोन के 5μg Linearize. 37 पर 2-3h लिए सेते डिग्री सेल्सियस Linearized Qiagen QIAprep स्पिन Miniprep किट वैकल्पिक शुद्धि प्रोटोकॉल का उपयोग डीएनए, 50 μL RNase मुक्त पानी का उपयोग स्पिन स्तंभ से डीएनए eluting शुद्ध. प्लाज्मिड एकाग्रता लगभग μg μL / 1.0 होना चाहिए. एक RNase मुक्त 0.2 एमएल पीसीआर ट्यूब में, सेट अप एक 50 μL प्रतिलेखन प्रतिक्रिया प्रोटोकॉल प्रति Ambion MAXIscript किट का उपयोग कर के रूप में निम्नानुसार है. 22.5 μL RNase मुक्त DH 2 हे 5.0 μL linearized डीएनए टेम्पलेट (1.0 μg / μL) 2.5 μL 10mm एटीपी 2.5 μL 10mm CTP 2.5 μL 10mm UTP 2.5 μL 1mm GTP 2.5 μL 10mm टोपी अनुरूप जी (मीटर जी 7 (5) (पीपीपी 5 ')) 5.0 μL 10X प्रतिलेखन बफर 5.0 μL T7 या SP6 पोलीमरेज़ मिश्रण 50.0 μL कुल 37 पर 1 घंटे के लिए प्रतिलेखन प्रतिक्रिया सेते डिग्री सेल्सियस ऊष्मायन के बाद, प्रतिक्रिया BHK-21 कोशिकाओं की electroporation के लिए तत्काल किया जाना चाहिए. Electroporation के लिए BHK-21 कोशिकाओं की तैयारी ऊष्मायन प्रतिलेखन प्रतिक्रिया के दौरान शुरू करना चाहिए. 2. वायरस के संक्रामक शाही सेना से पीढ़ी दो 70-80 मिला हुआ 150 2 सेमी (टी 150) फ्लास्क एटीएस प्रति कोशिकाओं BHK-21% Trypsinize. एक 15 एमएल शंक्वाकार अपकेंद्रित्र ट्यूब के सभी कक्षों का स्थानांतरण. गोली centrifugation द्वारा rpm 2000 में कोशिकाओं, 10 मिनट, 4 ° एक पारंपरिक tabletop अपकेंद्रित्र में सी. बिना बाँझ पीबीएस में Resuspend कोशिकाओं मिलीग्राम + + और Ca + +. 2.3 और 2.4 चरणों को दोहराएँ जब तक कोशिकाओं पीबीएस के साथ किया गया है तीन बार धोया. Pelleted कोशिकाओं 0.5 एमएल 10% FBS युक्त सदस्य Resuspend. 10% FBS के साथ 90 μL सदस्य के साथ 10 μL कोशिकाओं पतला और एक hemacytometer पर भरोसा है. यदि आवश्यक हो, 2.5-12.5 x 10 7 सदस्य 10% FBS युक्त के साथ कोशिकाओं / एमएल पतला कोशिकाओं . एक बर्फ का ठंडा 0.2 सेमी electroporation क्युवेट करने के लिए, 400 μL सेल निलंबन और 20 μL प्रतिलेखन प्रतिक्रिया जोड़ें. क्युवेट से संक्षेपण साफ कर लें. 450V, 1200Ω, 150 μF: दो बार क्युवेट पल्स. हम एक इलेक्ट्रो सेल मैनिप्युलेटर, हार्वर्ड उपकरण ECM630 मॉडल का उपयोग करें. एक 25 2 सेमी टिशू कल्चर 10% FBS के साथ 5 एमएल सदस्य युक्त कुप्पी में क्युवेट की संपूर्ण सामग्री रखें . 37C पर सेते (ओं) 5% सीओ 2 के साथ कुप्पी . संक्रमण दैनिक मॉनिटर कि उचित फिल्टर सेट (जैसे GFP फिल्टर के साथ एक औंधा फ्लोरोसेंट खुर्दबीन का उपयोग कर उत्तेजना = 460-490 एनएम तरंगदैर्ध्य, उत्सर्जन = 510-550 एनएम तरंगदैर्ध्य, या dsRed फिल्टर: उत्तेजना तरंगदैर्ध्य = 460-560 एनएम, उत्सर्जन तरंगदैर्ध्य => 590 एनएम). प्रतिदीप्ति पता चलता है, जब संक्रमण है मिला हुआ और / या CPE कुप्पी भर में दिखाई देता है, कुप्पी की सामग्री इकट्ठा, 30% FBS जोड़ने के लिए, आवश्यक है, और दुकान के रूप में -80 पर विभाज्य डिग्री सेल्सियस अगर वांछित, सेल lysates centrifugation द्वारा मंजूरी दे दी हो सकता है (2000 rpm, 10 मिनट, 4 डिग्री सेल्सियस) से पहले FBS के अलावा. बाद रक्त खिला assays के लिए वायरस टिटर वृद्धि करने के लिए कोशिकाओं का एक नया फ्लास्क के माध्यम से पारित होने के कम से कम एक बार वायरस. 3. मच्छरों के प्रति बहुत संक्रमण (आमतौर पर de-fibrinated भेड़ रक्त खरीदा है) रक्त और सेल संस्कृति व्युत्पन्न 2.13 कदम से वायरस निलंबन एक साथ मिक्स. रक्त भोजन में अंतिम वायरस टिटर आमतौर पर ~ 1×10 7 पट्टिका गठन इकाइयों (pfu) / मच्छर के कुशल midgut संक्रमण के लिए एमएल होना चाहिए . 0.02M के अंतिम एकाग्रता के लिए लालच से खाना, 5'-triphosphate (एटीपी) adenosine मच्छरों को प्रोत्साहित करने के लिए जोड़ा जा सकता है है. मच्छरों हो सकता हैपानी और चीनी से वंचित हो सकता है संक्रमण से पहले उन्हें एक कृत्रिम फीडर से कुशलता से रक्त फ़ीड करने के लिए प्रोत्साहित करने के लिए है. अभाव की अवधि पहले मृत्यु दर को कम करने के लिए स्थापित किया जाना चाहिए. टाइम्स मच्छर प्रजातियों, एक प्रारंभिक बिंदु के रूप में insectary आदि की नमी पर निर्भर करती है, चीनी 24 घंटों का और पानी 12h फ़ीड करने के लिए पहले से निकाल देंगे. इस प्रोटोकॉल के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पानी परिसंचारी पानी तख्ताबंदीवाला feeders17 कांच का उपयोग करता है. एक सुअर आंतों की झिल्ली (यानी सॉसेज अच्छी तरह से धोया सबसे किराने की दुकानों में उपलब्ध आवरण) फीडर और भोजन कक्ष में pipetted है के मुँह पर रखा गया है. विभिन्न डिजाइन, झिल्ली, और प्रोटोकॉल अलग वेक्टर प्रकार के लिए उपलब्ध हैं. मच्छरों केवल उन खून के साथ engorged मच्छरों का चयन करने के लिए हल कर रहे हैं. Organdy साथ engorged मच्छरों एक दफ़्ती के लिए स्थानांतरित कर रहे हैं और शीर्ष पर मच्छरों 28 में incubated कर रहे हैं डिग्री सेल्सियस, 75-80% तक GFP अभिव्यक्ति के लिए संसाधित सापेक्ष आर्द्रता. 4. मच्छरों के intrathoracic टीका Intrathoracic टीका सन्धिपाद संक्रमण के लिए एक वैकल्पिक तरीका है. इस विधि जब midgut के माध्यम से प्रचार – प्रसार की आवश्यकता नहीं है प्रयोग किया जाता है. (विधि नीचे वर्णित है, लेकिन तकनीक के इस दृश्य प्रयोग में नहीं दिखाया गया है). मच्छरों की एक छोटी संख्या (5-10) प्लास्टिक पकड़े ट्यूबों में पकड़े पिंजरों से aspirated है. सील पकड़े ट्यूब 4 में रखा जाएगा डिग्री सेल्सियस के लिए 15 मिनट मच्छरों ठंडा करने के लिए. 2 5 मच्छरों एक गिलास पेट्री बर्फ पर आराम पकवान पर ट्यूब से गिरा दिया जाएगा. पेट्री डिश पर ढक्कन प्लेस जब उपयोग में नहीं है या यदि मच्छरों के लिए कदम के आसपास शुरू. मच्छरों की हैंडलिंग के दौरान देखभाल गिनती और जा रहा है चालाकी से मच्छरों की संख्या का ट्रैक रखने के लिए लिया जाना चाहिए. के रूप में मच्छरों चिल मेज पर गिरा रहे हैं, कुल संख्या एक प्रयोगशाला काउंटर पर दर्ज किया जाएगा. सुई केशिका टयूबिंग पिघलने Nanoject विशिष्ट गिलास और एक सुई खींचने का उपयोग करके तैयार की है. 69 NL inoculum के वितरण के लिए निर्माता के निर्देशों के अनुसार Nanoject द्वितीय microinjector सेटअप. देखभाल जब सुई में inoculum इतना है कि ड्राइंग सुई क्षतिग्रस्त नहीं है प्रयोग किया जाना चाहिए. एक विदारक सूक्ष्मदर्शी का प्रयोग, मच्छर की छाती में सुई डालने और टीका के लिए Nanoject सक्रिय. देखभाल जब मच्छरों inoculating सुई पूरी तरह से इतना है कि मच्छर नहीं घुसना पड़ता है और दूसरी तरफ से बाहर निकलें, मच्छर के बाद मौत में जिसके परिणामस्वरूप के लिए प्रयोग किया जाना चाहिए. प्रत्येक मच्छर की जाँच के लिए यकीन है कि inoculum यह सुई से हटाने से पहले प्रवेश किया हो. टीकाकरण के बाद, जबकि मच्छर अभी भी सुई पर impaled है, पक्ष है कि कपास के साथ या अन्य सभी बार में एक काग डाट खामियों को दूर किया है में एक छोटे से छेद के माध्यम से एक कागज पकड़े दफ़्ती में यह जगह. जब मच्छरों inoculated और (लगभग 50 दफ़्ती प्रति) दफ़्ती, ध्यान से टेप जगह में काग मच्छरों की आकस्मिक रिहाई को रोकने में रखा. 28 डिग्री सेल्सियस और 80% सापेक्ष आर्द्रता insectary में आगे ऊष्मायन से पहले सुरक्षित पकड़े बिन में डिब्बों रखें. 5. मच्छरों की निगरानी संक्रमण 4 में पकड़े दफ़्ती कागज प्लेस डिग्री सेल्सियस लगभग 15 मिनट के लिए मच्छरों को स्थिर करने के लिए. एक सर्द एक फ्लोरोसेंट खुर्दबीन पर उपयोग के लिए अनुकूलित तालिका मच्छरों की एक छोटी संख्या (एक समय में 50-10) स्थानांतरण. या प्रतिदीप्ति की उपस्थिति या अनुपस्थिति पर आधारित मच्छरों की जांच करने और सॉर्ट करें. इसके अतिरिक्त, फ्लोरोसेंट तीव्रता संक्रमण के एक प्रॉक्सी मात्रात्मक माप के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है. Midguts, लार ग्रंथियों के रूप में मच्छर के ऊतकों, वसा शरीर और dissected किया जा सकता है प्रतिदीप्ति के लिए निगरानी. यदि उपयुक्त हो, कागज दफ़्ती के लिए चयनित मच्छरों को लौटने के लिए संक्रमित मच्छरों के ऊष्मायन जारी है. 6. पारेषण परख (मजबूर वायरस संचरण प्रदर्शन राल निकालना) 24 घंटे पहले के लिए फ़ीड के लिए चीनी स्रोत के मच्छरों वंचित. पैर और पंखों निकालें एक 50 μL केशिका ट्यूब है कि गरम किया गया है, खींच लिया और एक अंत में snipped, Cargille टाइप बी विसर्जन तेल या 10% सीरम – sucrose के समाधान के 3-5 μL जोड़ें. ट्यूब में सूंड डालें. यदि तेल का उपयोग करते हुए, लार की बूंदों सूंड से पसीजना देखा जाएगा. पीबीएस में एक 1% pilocarbine समाधान और 0.1% 80 बीच का एक μL को प्रोत्साहित छाती करने के लिए लागू किया जा सकता है. 60-90 मिनट के बाद, मच्छरों को हटा दें और यदि आवश्यक वायरस अलगाव के लिए दुकान. ट्यूब से एक 100 μL 20% FBS – पीबीएस युक्त ट्यूब में centrifugation से समाधान निकालें. बाँझ inoculum 0.2 सुक्ष्ममापी सिरिंज फिल्टर के माध्यम से फिल्टर और तब फ़िल्टर inoculum का उपयोग करने के लिए संवर्धित कोशिकाओं को संक्रमित. जैवसुरक्षा नोट: इस प्रोटोकॉल का वर्णनपैदा की पहचान, और संक्रमित मच्छरों की निगरानी के लिए एक विधि है. आपके सुविधाएं (यानी एक चिल तालिका, नियंत्रण सुविधा, आदि) और IBC अनुमोदन के आधार पर, आप उन्हें पंख और पैरों को हटाने के लिए भागने को रोकने के बाद ही जांच सीमित किया जा सकता है. एटीएस SINV-आधारित और उत्पन्न किया जा सकता है एक BSL2 वातावरण में प्रयोग किया जाता है. एटीएस के उपयोग जैसे अन्य alphaviruses चिकनगुनिया वायरस या पश्चिमी इक्वाइन इन्सेफेलाइटिस वायरस पर आधारित है BSL3 सुविधाओं की आवश्यकता होगी. 7. प्रतिनिधि परिणाम एक मार्कर जीन (GFP) एटीएस 5'dsMRE16 / GFP का उपयोग कर की अभिव्यक्ति का एक सिंहावलोकन चित्र 1 में दिखाया गया है. GFP के BHK-21 और C6/36 कोशिकाओं (एडीज albopictus) में अभिव्यक्ति 0.01 संक्रमण की बहुलता पर 5'dsMRE16 / GFP वायरस के साथ कोशिकाओं के संक्रमण के बाद किसी विशिष्ट समय पर चित्रा 2 में दिखाया गया है . चित्रा 3 मच्छर जब वायरस एक संक्रामक रक्त भोजन के माध्यम से वितरित किया जाता है में alphavirus और एटीएस वायरस के संक्रमण के एक सिंहावलोकन है. चित्रा 4 ~ 10 7 pfu / एमएल एटीएस वायरस के एडीज aegypti के मौखिक संक्रमण द्वारा पीछा के साथ एक रक्त भोजन की तैयारी से पता चलता है. संक्रमित मच्छर और 10 दिनों के बाद संक्रमण पर चयनित शरीर के अंगों को एक epifluorescence खुर्दबीन (चित्रा 5) का उपयोग कर के पूरे शरीर को देखने. GFP का पता लगाने और संक्रमित मच्छरों के एटीएस 5'dsMRE16 प्रत्येक मार्कर फ्लोरोसेंट जीन (चित्रा 6) व्यक्त वायरस के साथ संक्रमण के बाद midguts में dsRED. पारेषण / 5'dsMRE16 GFP एटीएस वायरस (चित्रा 7) के साथ संक्रमित मच्छरों का उपयोग परख. तालिका 1. एटीएस वर्तमान में मच्छरों में जीन की अभिव्यक्ति के लिए इंजीनियर है.   Alphavirus एटीएस मच्छर संदर्भ Sindbis वायरस ते / 3'2J और ते / 5'2J एडीज aegypti 12 Ochlerotatus triseriatus 13 3'dsMRE16 और 5'dsMRE16 ए aegypti 5 क्युलेक्स tritaeniorhynchus 5 5'dsTR339 ए AEG ypti 2 चिकनगुनिया वायरस 3'dsCHIKV और 5'dsCHIKV ए aegypti / ए albopictus 20 O'nyong nyong वायरस 5'dsONNV एनोफ़ेलीज़ gambiae 1,9 पश्चिमी इक्वाइन इन्सेफेलाइटिस वायरस 5'dsWEEV. मैकमिलन क्युलेक्स tarsalis Stauft एट अल अप्रकाशित. तालिका 2 / मच्छरों में जीन की अभिव्यक्ति के लिए एटीएस का उपयोग कर के लाभ और नुकसान .. लाभ: उच्च टिटर वायरस के तेजी से उत्पादन ब्रॉड मेजबान रेंज (SINV) उच्च शाही सेना प्रतिकृति दर उच्च transgene अभिव्यक्ति के स्तर छेड़खानी जीनों के रिश्तेदार आसानी स्थिर, कीड़े में लगातार जीन अभिव्यक्ति कीड़े में मिनिमल विकृति नुकसान: लघु अवधि के हड्डीवाला कोशिकाओं में अभिव्यक्ति मोड हड्डीवाला कोशिकाओं पर मजबूत cytopathic प्रभाव जीन आकार प्रतिबंध (<1kb, आदर्श) कुछ alphaviruses BSL3 रोकथाम की आवश्यकता चित्रा 1: एटीएस BHK 21 / p5'dsMRE GFP SINV व्यक्त GFP का उपयोग कोशिकाओं में वायरस उत्पादन का अवलोकन . इन विट्रो प्रतिलेखन में बाद जीनोमिक एटीएस शाही सेना BHK 21-कोशिकाओं जहां वायरस बचाया है में electroporated है . एटीएस वायरस तो मच्छरों को संक्रमित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. SGP = subgenomic प्रमोटर. एटीएस शाही सेना के तीन प्रजातियों cel में लिखितरास, जीनोमिक, 1 subgenomic और subgenomic 2 RNAs. सी (capsid), E2 और E1 glycoproteins एटीएस जीनोम के साथ संक्रामक वायरस उत्पन्न इकट्ठा कर रहे हैं. चित्रा 2: SINV वायरस / 5'dsMRE16 GFP के साथ संक्रमण के बाद मच्छर में GFP (C6/36) की अभिव्यक्ति की कोशिकाओं. चित्रा 3: वायरस संचरण के लिए अग्रणी मच्छरों में एटीएस के एक वायरस के संक्रमण का अवलोकन. चित्रा 4: एटीएस SINV एक संक्रामक रक्त भोजन करने के लिए मच्छरों को उजागर द्वारा 5'dsMRE16 संक्रमण . चित्रा 5: 10 दिनों के बाद संक्रमण पर एटीएस SINV संक्रमण / 5'dsMRE16 GFP. GFP के पूरे शरीर का पता लगाने से पता चलता है कि वायरस midgut बच गया है और माध्यमिक ऊतकों के लिए फैलाया. चित्रा भी चयनित शरीर के अंगों भी है कि एक फैलाया संक्रमण के संकेत है में GFP अभिव्यक्ति से पता चलता है. चित्रा 6: एटीएस SINV 5'dsMRE16 / GFP और 5'dsMRE16 / विशिष्ट समय के बाद संक्रमण midguts के dsRED संक्रमण. Midguts आम तौर पर एक रक्त भोजन युक्त वायरस है कि बाद में संक्रमण के बाद समय पर पीछे midgut भर से फैलता ingesting के बाद जल्दी संक्रमण के विशिष्ट foci है. चित्रा 7: 5'dsMRE16 एटीएस / मच्छर लार में GFP के 8 दिनों के बाद संक्रमण के रूप में जल्दी के रूप में जांच. परख एटीएस वायरस और पता चलता है कि वायरस / 5'dsMRE16 GFP stably मच्छर में बाह्य ऊष्मायन अवधि भर GFP व्यक्त कर सकते हैं के प्रसारण दिखाने के लिए डिज़ाइन किया गया है. बाईं पैनल एक केशिका ट्यूब में मुँह में पानी मच्छर से पता चलता है, केंद्र पैनल C6/36 1 दिन और सही पैनल 3 दिनों के बाद संक्रमण लार से संक्रमित कोशिकाओं से पता चलता है.

Discussion

यहाँ प्रस्तुत तरीकों शोधकर्ताओं ने मच्छर सेल संस्कृति और वयस्क मादा मच्छर में एक alphavirus के संक्रमण का पालन करने के लिए सक्षम है. एटीएस वायरस का उपयोग करने के फायदे और नुकसान तालिका 2 में संक्षेप हैं. एक एटीएस संक्रामक क्लोन आनुवंशिक हो सकता है किसी भी जीओआई व्यक्त छेड़छाड़ कर सकते हैं और एकल श्रृंखला एंटीबॉडी, आरएनएआई दमन, antisense RNAs अंतर्जात जीन लक्ष्यीकरण, और समर्थक apoptotic प्रोटीन को व्यक्त करने के लिए इस्तेमाल किया गया है. यदि एक पत्रकार को इस्तेमाल नहीं किया है, तो इस विधि का इमेजिंग भाग प्रासंगिक नहीं है. हालांकि, एक ही प्रोटोकॉल के कई एटीएस वायरस बचाव, प्रचार, और मच्छर संक्रमण के लिए आवश्यक हैं. Transgene के अधिक से अधिक आकार में सीमाएं हैं जब एक alphavirus transducing सिस्टम में डाला. आकार की कमी पैतृक एटीएस उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया तनाव के आधार पर भिन्न है, लेकिन 1kb के बारे में आम तौर पर कर रहे हैं, हालांकि बड़ा जुगनू luciferase जैसे रिपोर्टर जीन मच्छरों में उपयोग के लिए एटीएस निर्माण में इस्तेमाल किया गया है. विषाणु विज्ञान पृष्ठभूमि के एक मामूली राशि के साथ अनुसंधान प्रयोगशालाओं इन प्रोटोकॉल के बाद एटीएस का उपयोग करने में सक्षम होना चाहिए. SINV आधारित एटीएस का उपयोग ताकि अनुसंधान प्रयोगशालाओं की संख्या पहले से ही किया है.

Materials

Material Name	Tipo	Company	Catalogue Number	Comment
QIAprep Spin Miniprep Kit		Qiagen	27104
MAXIscript Kit		Ambion	AB1312	Be sure to use a kit containing the appropriate polymerase for your construct.
Cap Analogue (m7G(5′)ppp(5′)G)		Ambion	AM8050
Nanoject II nanoliter injector		Drummond Scientific	3-000-204
Electro Cell Manipulator		Harvard Apparatus	ECM 630