В данной статье приводится описание того, как анализировать и записывать с изолированной сетчатки препарат в мышь. В частности, мы описываем, как записывать свет ответы от флуоресцентно меченных популяции клеток ганглия, а затем определить и проанализировать его морфологии.
Первые шаги в позвоночных видения происходят, когда свет стимулирует палочек и колбочек, фоторецепторы сетчатки 1. Эта информация затем разделены на так называемые ВКЛ и ВЫКЛ путей. Фоторецепторов световой сигнал информацию биполярных клеток (БЦ), который деполяризовать в ответ на повышение (на БЦ) или уменьшается (Off БЦ) в интенсивности света. Это разделение света информация хранится на уровне ганглиозных клеток сетчатки (РГК), которые имеют дендриты стратификации в любом Off sublamina внутреннего слоя плексиформные (IPL), где они получают прямые возбуждающие вклад Off БЦ, или стратификации в На sublamina из IPL, где они получают прямые возбуждающие вклад На БЦ. Это разделение информации относительно увеличения или уменьшения освещения (включение и выключение пути) остается неизменной, а сигнал к мозгу параллельно.
РГК являются выход клетки сетчатки, и, таким образом, важные ячейки для изучения, чтобы понять, как свет информация сигналом для визуальной ядер в мозге. Прогресс в генетике мышей в течение последних десятилетий привели различные флуоресцентные репортер мыши линии, где конкретные РГК населения помечены флуоресцентным белком, чтобы для идентификации подтипов RGC 2 3 4 и таргетинга на электрофизиологические записи. Здесь мы представляем метод регистрации света ответы от флуоресцентно меченных ганглиозных клеток в неприкосновенности, изолированной сетчатки подготовки. Это изолировало сетчатки подготовка позволяет записей с РГК, где дендритных беседки не поврежден и входы на всей РГК беседка дендритных сохраняются. Этот метод применим в различных подтипов ганглиозных клеток и может принять самые разнообразные одноклеточные физиологических методов.
Этот метод применим к любой ганглиозных клеток сетчатки записи с изолированной сетчатки. Хотя у мышей линии, используемой выше внутренне светочувствительная, меланопсин экспрессирующих РГК помечены 2 EGFP, 5, этот протокол можно легко перенести в другие флуоресцентно меченных РГК …
Эта работа была частично поддержана грантами NIH R01EY012949, R21EY018885, T32 EY0707133. Мы благодарим Дарвина повесить за его техническую помощь.
Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
Ames’ Medium | Sigma | A1420 | ||
Collagenase | Whorthington Biochemical | LS005273 | ||
Hyaluronidase | Whorthington Biochemical | LS002592 | ||
Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761 | ||
AlexaFluor 594 Hydrazyde | Invitrogen | A10442 | ||
Neurobiotin | Vector Laboratories | SP1120 | ||
Electrodes | Sutter Instruments | BF120-69-10 | ||
Forceps | Fine Science Tools | 11252-30 | ||
Ophthalmologic Scissor | Fine Science Tools | 15000-00 | ||
Streptavidin 594 | Invitrogen | S32356 | ||
Vectashield | Vector Laboratories | H-1000 | ||
Goat Serum | Jackson ImmunoResearch | 005-000-001 | ||
Triton X-100 | Sigma | T8787 | ||
Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 19210 |