Изолированные сетчатки Подготовка к записи Света Ответ Генетически Маркированный ганглиозных клеток сетчатки
Summary
В данной статье приводится описание того, как анализировать и записывать с изолированной сетчатки препарат в мышь. В частности, мы описываем, как записывать свет ответы от флуоресцентно меченных популяции клеток ганглия, а затем определить и проанализировать его морфологии.
Abstract
Первые шаги в позвоночных видения происходят, когда свет стимулирует палочек и колбочек, фоторецепторы сетчатки 1. Эта информация затем разделены на так называемые ВКЛ и ВЫКЛ путей. Фоторецепторов световой сигнал информацию биполярных клеток (БЦ), который деполяризовать в ответ на повышение (на БЦ) или уменьшается (Off БЦ) в интенсивности света. Это разделение света информация хранится на уровне ганглиозных клеток сетчатки (РГК), которые имеют дендриты стратификации в любом Off sublamina внутреннего слоя плексиформные (IPL), где они получают прямые возбуждающие вклад Off БЦ, или стратификации в На sublamina из IPL, где они получают прямые возбуждающие вклад На БЦ. Это разделение информации относительно увеличения или уменьшения освещения (включение и выключение пути) остается неизменной, а сигнал к мозгу параллельно.
РГК являются выход клетки сетчатки, и, таким образом, важные ячейки для изучения, чтобы понять, как свет информация сигналом для визуальной ядер в мозге. Прогресс в генетике мышей в течение последних десятилетий привели различные флуоресцентные репортер мыши линии, где конкретные РГК населения помечены флуоресцентным белком, чтобы для идентификации подтипов RGC 2 3 4 и таргетинга на электрофизиологические записи. Здесь мы представляем метод регистрации света ответы от флуоресцентно меченных ганглиозных клеток в неприкосновенности, изолированной сетчатки подготовки. Это изолировало сетчатки подготовка позволяет записей с РГК, где дендритных беседки не поврежден и входы на всей РГК беседка дендритных сохраняются. Этот метод применим в различных подтипов ганглиозных клеток и может принять самые разнообразные одноклеточные физиологических методов.
Protocol
Discussion
Этот метод применим к любой ганглиозных клеток сетчатки записи с изолированной сетчатки. Хотя у мышей линии, используемой выше внутренне светочувствительная, меланопсин экспрессирующих РГК помечены 2 EGFP, 5, этот протокол можно легко перенести в другие флуоресцентно меченных РГК …
Acknowledgements
Эта работа была частично поддержана грантами NIH R01EY012949, R21EY018885, T32 EY0707133. Мы благодарим Дарвина повесить за его техническую помощь.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Ames’ Medium | Sigma | A1420 | ||
| Collagenase | Whorthington Biochemical | LS005273 | ||
| Hyaluronidase | Whorthington Biochemical | LS002592 | ||
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761 | ||
| AlexaFluor 594 Hydrazyde | Invitrogen | A10442 | ||
| Neurobiotin | Vector Laboratories | SP1120 | ||
| Electrodes | Sutter Instruments | BF120-69-10 | ||
| Forceps | Fine Science Tools | 11252-30 | ||
| Ophthalmologic Scissor | Fine Science Tools | 15000-00 | ||
| Streptavidin 594 | Invitrogen | S32356 | ||
| Vectashield | Vector Laboratories | H-1000 | ||
| Goat Serum | Jackson ImmunoResearch | 005-000-001 | ||
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | ||
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 19210 |
Referências
- Wassle, H. Parallel processing in the mammalian retina. Nat Rev Neurosci. 5, 747-757 (2004).
- Schmidt, T. M., Taniguchi, K., Kofuji, P. Intrinsic and extrinsic light responses in melanopsin-expressing ganglion cells during mouse development. J Neurophysiol. 100, 371-384 (2008).
- Huberman, A. D. Genetic identification of an On-Off direction-selective retinal ganglion cell subtype reveals a layer-specific subcortical map of posterior motion. Neuron. 62, 327-334 (2009).
- Siegert, S. Genetic address book for retinal cell types. Nat Neurosci. 12, 1197-1204 (2009).
- Schmidt, T. M., Kofuji, P. Functional and morphological differences among intrinsically photosensitive retinal ganglion cells. J Neurosci. 29, 476-482 (2009).
- Newman, E. A., Bartosch, R. An eyecup preparation for the rat and mouse. J Neurosci Methods. 93, 169-175 (1999).
- Haverkamp, S., Inta, D., Monyer, H., Wassle, H. Expression analysis of green fluorescent protein in retinal neurons of four transgenic mouse lines. Neurociência. 160, 126-139 (2009).
- Zhang, D. Q., Zhou, T. R., McMahon, D. G. Functional heterogeneity of retinal dopaminergic neurons underlying their multiple roles in vision. J Neurosci. 27, 692-699 (2007).
- Hu, E. H., Dacheux, R. F., Bloomfield, S. A. A flattened retina-eyecup preparation suitable for electrophysiological studies of neurons visualized with trans-scleral infrared illumination. J Neurosci Methods. 103, 209-216 (2000).
- Wu, S. M., Gao, F., Pang, J. J. Synaptic circuitry mediating light-evoked signals in dark-adapted mouse retina. Vision Res. 44, 3277-3288 (2004).
