Aqui nós descrevemos uma estratégia eficiente para remover as glândulas produtoras de seda do abdômen da fêmea aranha viúva negra. Este procedimento permite o isolamento rápido da produção de seda sete diferentes glândulas de uma forma altamente purificada, um processo importante para os investigadores a estudar a produção de seda de aranha e montagem de fibra.
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Artigo de método
Microdissecção de Black Widow Aranha Silk glândulas produtoras de
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Neste artigo
Resumo
Resumo
Aranhas modernas produzir fibras de alta performance de seda com uma ampla gama de funções biológicas, incluindo locomoção captura de presas e de proteção de desenvolver 1,2 filhos. Aranhas realizar essas tarefas, girando várias tipos de fibras distintas, que têm diferentes propriedades mecânicas. Tal especialização de tipos de fibras ocorreu através da evolução de diferentes glândulas produtoras de seda, que funcionam como biofábricas de pequeno porte. Estes fabricação biofábricas e armazenar grandes quantidades de proteínas da seda para a produção de fibra. Através de uma série complexa de eventos bioquímicos, essas proteínas da seda são convertidos de um líquido em um material sólido em cima de extrusão.
Estudos têm demonstrado que a mecânica sedas de aranha são mais fortes que aço de alta resistência 3. Análises para entender a relação entre a estrutura ea função dos fios de seda de aranha têm revelado que a seda da aranha é constituída principalmente de proteínas, ou fibroins, que repete bloco dentro suas seqüências de proteínas 4. Comum assinaturas moleculares que contribuem para a resistência à tração incrível e extensibilidade de sedas de aranha estão sendo desvendados através da análise de cDNAs de seda traduzido. Dadas as propriedades do material extraordinário de aranha sedas, laboratórios de pesquisa em todo o mundo estão correndo para compreender e imitar o processo de fiação para produzir fibras de seda sintética para aplicações comerciais, militares e industriais. Um dos principais desafios a fiação de seda de aranha artificial em laboratório de pesquisa envolve um completo entendimento dos processos bioquímicos que ocorrem durante a extrusão das fibras das glândulas produtoras de seda.
Aqui apresentamos um método para o isolamento de sete de produção de seda diferentes glândulas da aranha viúva-negra cobweaving, que inclui as glândulas ampullate maiores e menores [fabrica dragline e andaimes de seda] 5,6, tubuliform [sintetiza seda caso do ovo] 7 , 8, flagelliform [função desconhecida em cob-tecelões], agregada [faz seda cola], aciniform [embrulho presa sintetiza e tópicos caso do ovo] 9 e piriforme [produz apego seda disco] 10. Esta abordagem baseia-se anestesiar a aranha com gás de dióxido de carbono, a separação posterior do cefalotórax do abdômen, e microdissecção do abdômen para obter as glândulas produtoras de seda. Após a separação dos diferentes glândulas produtoras de seda, estes tecidos podem ser usados para recuperar macromoléculas diferentes para distintas análises bioquímicas, incluindo quantitativos PCR em tempo real, no norte e oeste blotting, espectrometria de massa (MS ou MS / MS) analisa a identificar seqüências de seda novas proteínas, pesquisa de proteínas que participam na via montagem de seda, ou usar o tecido para cultura de células intactas ou experiências histológica.
Protocolo
1. Anestesiar a aranha e isolamento do abdômen
- Transferência a aranha a partir de um frasco de vidro em uma caixa de papelão forrada com plástico (Figura 1A). Normalmente, coletamos as aranhas de woodpiles, garagens ou arbustos e abrigá-los no laboratório em frascos de vidro. Porque a aranha não pode subir o revestimento de plástico, ela fornece um método eficiente para transferir a aranha a partir de uma jarra de vidro ou lata de café em um pequeno frasco para fins de anestesia. Ao manusear a aranha, neste ponto, você deve estar usando dois pares de luvas de látex ou luvas de jardinagem para fins de segurança.
- Enquanto a aranha está na caixa for....
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Discussão
Nossa metodologia para a microdissecção das glândulas produtoras de seda da aranha viúva-negra oferece um meio eficaz para obter altamente purificada de seda glândulas produtoras. Dissecções podem ser concluídas em 1,5 a 3 horas, resultando em um conjunto completo de sete distintas seda glândulas produtoras de cobweavers. Obtenção altamente purificada de seda glândula-amostras permite os investigadores a capacidade de executar uma ampla gama de estudos bioquímicos, incluindo a identificação de seda novo ou proteínas cha.......
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Divulgações
Não há conflitos de interesse declarados.
Agradecimentos
Este trabalho foi financiado por uma doação RUI NSF MCB-0950372 Caracterização Molecular de direito Silks aranha viúva negra.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Cloreto de sódio | Electron Microscopy Sciences | SX0420-1 | 0,1 M em água |
| Pirocarbonato de dietila | Sigma-Aldrich | D-5758 - 5 ml | 0,1% v/v |
| Citrato de sódio | Sigma-Aldrich | S1804 - 1 kg | 0,015 M em água |
| Microscópio estereoscópico | Leica Microsystems | Leica MZ16 | |
| Câmera digital para microscópio | Leica Microsystems | DFC320 | Software - Leica Application Suite v2.8.1 |
| Tesoura de Vannas | World Precision Instruments, Inc. | 500260 | |
| Pinzas de aço inoxidável | World Precision Instruments, Inc. | 501764 | Mini Dumont nº M5S |
| Agulhas para insetos | Indigo Instruments | 33414-2 | Agulhas para insetos nº 2 |
| Placas de dissecação pequenas ou grandes | Living Systems Instrumentation | DD-50-S ou DD-90-S | 52 mm de diâmetro x 18 mm de altura (profundidade do Sylgard ~6 mm) ou 93 mm x 22 mm |
| Drosophila tubos de cultura | Carolina Biological | FR-17-3076 | O tamanho é 31,75 mm de diâmetro x 101,6 mm |
Referências
- Vollrath, F., Knight, D. P. Int. J. Biol. Macromol. 24, 243-243 (1999).
- Gosline, J. M., Guerette, P. A., Ortlepp, C. S. J. Exp. Biol. 202, 3295-3295 (1999).
- Gosline, J. M., DeMont, M. E., Denny, M. W. Endeavour. 10, 31-31 (1986).
- Hinman, M. B., Jones, J. A., Lewis, R. V. Trends Biotechnol. 18 (9), 374-374 (2000).
- Lewis, R. V., Xu, M. Proc. Natl. Acad. Sci. 87, 7120-7120 (1990).
- Colgin, M. A., Lewis, R. V. Protein Sci. 7 (3), 667-667 (1998).
- Tian, M., Lewis, R. V. Appl. Phys....
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Reimpressões e permissões
