अति समृद्ध Neuronal संस्कृतियों की पीढ़ी के लिए cortical ऊतक ब्लाकों के cryopreservation

Summary

यहाँ, हम कुशल cryopreservation के लिए एक विधि का वर्णन और cortical मस्तिष्क के ऊतकों ब्लॉक के विगलन अत्यधिक समृद्ध neuronal संस्कृतियों उत्पन्न. यह सरल प्रोटोकॉल neuronal, astrocyte, और neuronal अग्रदूत सेल संस्कृतियों के बाद की पीढ़ी के लिए लचीलापन प्रदान करता है.

Abstract

इस अध्ययन में, हम सफल cryopreservation और cortical मस्तिष्क के ऊतकों ब्लॉक के विगलन अत्यधिक समृद्ध neuronal संस्कृतियों उत्पन्न करने के लिए एक मानकीकृत प्रोटोकॉल की रूपरेखा. इस प्रोटोकॉल के लिए ठंड इस्तेमाल किया मध्यम 10% डाइमिथाइल sulfoxide (DMSO) हांक buffered नमक समाधान (HBSS) में पतला है. Cortical ऊतक के ब्लाकों ठंड मध्यम युक्त cryovials को हस्तांतरित कर रहे हैं और धीरे धीरे -1 डिग्री सेल्सियस दर नियंत्रित ठंड कंटेनर में / मिनट पर जमे हुए हैं. पोस्ट पिघलना प्रसंस्करण और जमे हुए ऊतक लगातार neuronal समृद्ध संस्कृतियों जो संस्कृति और neuronal नेटवर्क के विस्तार में महत्वपूर्ण में पहले 5 दिनों के दौरान 10 दिनों के भीतर तेजी से neuritic वृद्धि प्रदर्शन का उत्पादन ब्लॉक के पृथक्करण. Astrocytic मार्कर glial fibrillary अम्लीय (GFAP) प्रोटीन और neuronal मार्कर बीटा ट्यूबिलिन वर्ग III, के साथ Immunocytochemical धुंधला हो जाना और संस्कृतियों में न्यूरॉन्स और astrocytes की उच्च संख्या का पता चला. तंत्रिका ऊतक ब्लॉक हदबंदी के बाद अग्रदूत सेल संस्कृतियों की पीढ़ी तेजी से neurospheres, जो फर्क शर्तों के तहत न्यूरॉन्स और astrocytes की बड़ी संख्या का उत्पादन विस्तार में हुई. यह सरल cryopreservation प्रोटोकॉल cortical मस्तिष्क के ऊतकों ब्लॉक के तेजी से, कुशल और सस्ती संरक्षण, जो neuronal, astrocyte, और neuronal अग्रदूत सेल संस्कृतियों के बाद की पीढ़ी के लिए बढ़ लचीलेपन के अनुदान के लिए अनुमति देता है.

Protocol

1. Cortical ऊतक ब्लाकों के cryopreservation सामग्री तैयार करना बाँझ पानी (01:09) में 10X शेयर समाधान पर गिराए 1X हांक buffered नमक समाधान (HBSS) तैयार करें. 4oC पर स्टोर HBSS. HBSS (01:09) में गिराए DMSO के द्वारा 10% DMSO ठंड मध्यम तैयार. ठंड मध्यम cryopreservation के पहले हो ताजा किया जाना चाहिए और 4oC पर संग्रहीत जब तक ठंडा. एक इस्पात धार ऊतक के व्यवस्थित काट के लिए प्रयोग किया जाता है. उपयोग करने से पहले, रेजर ब्लेड 2 घंटा के लिए 70% इथेनॉल में डुबकी द्वारा निष्फल है. तुरंत ऊतक प्रसंस्करण से पहले, साथ बाँझ पानी 3 बार उस्तरा ब्लेड कुल्ला. बाँझ पानी में समय का एक अत्यधिक राशि के लिए उस्तरा, छोड़ने के रूप में यह ऑक्सीकरण के लिए प्रवण है से बचें. एक Nalgene ठंड कंटेनर cryovials (2.5 एमएल) के साथ भरी हुई है और फिर एक बाँझ जैविक कैबिनेट में लाया. ठंडा ठंड माध्यम के 1 एमएल प्रत्येक शीशी में जोड़ा है. ठंड कंटेनर तो कम से कम 2 घंटे के लिए 4oC पर रखा. सफाई, काट, और बर्फ़ीली मस्तिष्क ऊतक के लिए जमे हुए किया जा meningeal झिल्ली और रक्त वाहिकाओं के साफ किया जाता है. बाँझ सुई युक्तियों का उपयोग ध्यान से ऊतक से मलबा हटाने जबकि एक आइस पैक के शीर्ष पर काम कर रहा है. साफ ऊतक ठंड HBSS के साथ हल्के rinsed चाहिए और काट के लिए एक नया पेट्री डिश को हस्तांतरित. एक आइस पैक के शीर्ष पर कार्य करना, एक निष्फल रेजर ब्लेड का उपयोग करने के लिए तेजी से लगभग 1 मिमी 3 ब्लॉक में ऊतक काटना. काट प्रक्रिया पर बेहतर नियंत्रण में एक समय परिणामों पर साफ ऊतक के छोटे हिस्से के साथ कार्य करना, अधिक वर्दी ब्लॉक के आकार में जिसके परिणामस्वरूप. धीरे धीरे HBSS के 50 एमएल में 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में कटा ऊतक जोड़ें. धीरे HBSS के साथ पेट्री डिश कुल्ला क्रम में किसी भी शेष ऊतक ब्लॉक इकट्ठा है. ऊतक ब्लॉक ट्यूब के नीचे करने के लिए उतरना करने के लिए, एक शिथिल पैक ऊतक ब्लॉक गोली बनाने की अनुमति दें. जबकि ऊतक जम रही है, जैविक सुरक्षा कैबिनेट में पहले ठंडा ठंड कंटेनर और cryovials ले आओ. सभी cryovials खुलना ऊतक जोड़ने की प्रक्रिया की रफ्तार बढ़ के लिए. आखिर ऊतक ब्लॉक तय हो चुका है, धीरे अतिरिक्त HBSS aspirate, गोली ऊपर मीडिया के एक बहुत पतली परत छोड़ने. Centrifugation के रूप में यह ऊतक ब्लॉक एक दूसरे का पालन करने के लिए कारण होगा करने के लिए हतोत्साहित किया जाता है, काफी ठंड दक्षता ह्रासमान. धीरे – धीरे ढीली ऊतक ब्लॉक गोली के नीचे से विस्तृत orifices (बाँझ कैंची से टिप कटौती) के साथ विंदुक टिप का उपयोग करके 200 μL इकट्ठा. एक cryovial सामग्री स्थानांतरण और अगले, फिर से इकट्ठा करने के ऊतकों पर गोली के नीचे से ले जाने. यह आवश्यक है कि पूरे ऊतक आवंटन प्रक्रिया ठंड कंटेनर प्रति 3-4 मिनट से अधिक नहीं ले करता है. यह सुनिश्चित करता है कि ऊतक ठंड से पहले ही समय की एक छोटी अवधि के लिए DMSO से अवगत कराया है. शीशियों के लिए ऊतक स्थानांतरित करने के बाद, कम से कम 4 घंटे के लिए एक 80oC फ्रीजर में ठंड कंटेनर जगह. वैकल्पिक रूप से, ठंड कंटेनर oC -80 में रात भर छोड़ा जा सकता. किसी भी शेष ठंड कंटेनरों के लिए इस प्रक्रिया को दोहराएँ. ठंड कंटेनर (ओं) से एक और लंबी अवधि के भंडारण के लिए जगह एक तरल नाइट्रोजन टैंक में cryobox cryovials स्थानांतरण. 2. विगलन और जमे हुए cortical ऊतक ब्लाकों के संवर्धन सामग्री तैयार करना एक दिन पहले विगलन ऊतकों के नमूनों, पाली एल lysine लेपित पेट्री / व्यंजन coverslips तैयार हैं. सामान्य में, cortical न्यूरॉन्स के लिए हम 500 μg / एमएल / या 1mg एमएल के साथ लेपित व्यंजन तैयार है. पूरी तरह से पकवान के नीचे कवर पर्याप्त पाली एल lysine समाधान (borate बफर में किए गए ) जोड़ें. यदि कांच coverslips आवश्यक हैं सुनिश्चित करने के लिए, कि वे पूरी तरह से पाली एल lysine समाधान के तहत जलमग्न हैं . कम से कम 12 घंटा के लिए सेते हैं. उपयोग करने से पहले अच्छी तरह से बाँझ पानी की एक उदार राशि के साथ व्यंजन 3 बार, 5 मिनट प्रत्येक कुल्ला. गर्म HBSS thawed के रूप में अच्छी तरह के रूप में ऊतकों सेल निलंबन में ऊतकों को अलग कर देना साफ करने के लिए प्रयोग किया जाता है. जरूरत HBSS की मात्रा thawed जा ऊतक की मात्रा पर निर्भर करता है अलग अलग है, लेकिन आम तौर पर 1 cryovial HBSS के 50 एमएल में कमजोर होगी और HBSS के 10 एमएल में अलग हो जाएगा. Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम के साथ 10% लोहे के पूरक गोजातीय बछड़ा सीरम (ईबीएस) और 1% / एंटीबायोटिक antimycotic (एए) मिश्रण (DMEM (++)) एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में रखा जाना चाहिए. चढ़ाना मध्यम (नो बॉल (+++)) उपयोग करने से पहले ताजा किया जाना चाहिए. यह मध्यम 1% एंटीबायोटिक / antimycotic प्लस B27 और N2 खुराक जोड़कर तैयार है. नोट: मीडिया पार (+) के साथ संलग्न नाम मीडिया के आधार संरचना के लिए additives के शामिल किए जाने से संकेत मिलता है. इस पाठ में, DMEM (+) अर्थ DMEM प्लस 10% ईबीएस प्लस 1% ए.ए., जबकि नायब (+++) अर्थ एनबी plहमें% 1 ए.ए. प्लस B27 प्लस N2. विगलन और संवर्धन तरल नाइट्रोजन टैंक से cryovials निकालें और तेजी से 37 पर पिघलना ° केवल एक छोटा सा बर्फ गोली तक एक पानी के स्नान में सी शीशी सामग्री के अंदर मनाया जाता है. धीरे से एक चोटीदार ट्यूब में 50ml गर्म HBSS शीशी सामग्री हस्तांतरण. एक विस्तृत छिद्र टिप का उपयोग धीरे से किसी भी शेष ऊतक cryovial में फंस ब्लॉक बेदखल. ट्यूब 3-4 बार उलटें और ऊतक धीरे धीरे नीचे पर इकट्ठा करने के लिए अनुमति देते हैं. ऊतक जल्दी से व्यवस्थित करना चाहिए, लेकिन अगर ब्लॉक बहुत छोटे हैं यह होते हैं और नहीं centrifugation (~ 200 छ x) प्रकाश की सिफारिश की है हो सकता है. अतिरिक्त HBSS Aspirate. ऊतक गोली और 0.25% trypsin और DNAase के 50 μL की 300 μL गर्म HBSS के 10 एमएल जोड़ें. 5 मिनट, फिर एक कक्षीय प्रकार के बरतन में जगह के लिए एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में सेते rpm 80 और 37 डिग्री सेल्सियस एक अतिरिक्त 5 मिनट के लिए सेट. इस अवधि के बाद, एक जैविक सुरक्षा कैबिनेट में ऊतक ब्लॉकों लाने के लिए और एक 10 एमएल पिपेट का उपयोग ध्यान से ऊतक ब्लॉक आंदोलन है जब तक बादल सेल निलंबन का गठन किया है. गर्म DMEM के 10 एमएल जोड़कर trypsin निष्क्रिय (+) सेल निलंबन के लिए. 5 मिनट के लिए 1200 x छ dissociated कोशिकाओं अपकेंद्रित्र. Aspirate और सतह पर तैरनेवाला त्यागने के लिए, गर्म DMEM के 10 एमएल में सेल गोली resuspend (+) और सेल नंबर का उपयोग कर एक hemocytometer यों. पाली – एल lysine लेपित व्यंजन पर प्लेट कोशिकाओं. आमतौर पर, एक 60 मिमी पकवान 1×10 6 कोशिकाओं से मढ़वाया जाएगा. कोशिकाओं पकवान / टिशू कल्चर इनक्यूबेटर में लगभग 1 घंटा के लिए coverslips को संलग्न करने की अनुमति दें. यह एक थाली में कुर्की की प्रगति जब तक हर 10 मिनट पर नजर रखने के प्रभावी लगाव मनाया जाता है की सिफारिश की है. फिर, धीरे ताजा DMEM (++). साथ माध्यम की जगह 24 घंटे के बाद, DMEM जगह (+ +) गर्म एनबी (+++). साथ आंशिक मध्यम परिवर्तन (50%) बाहर ले हर 5 दिनों ताजा नो बॉल (+++). के साथ स्वस्थ संस्कृतियों आम तौर पर भेदभाव और 24 बजे के बाद प्रक्रियाओं के विकास के लक्षण दिखाते हैं. इन शर्तों के तहत, और हर 4-5 दिनों आंशिक मध्यम परिवर्तन प्रदर्शन, संस्कृतियों 4-6 सप्ताह के लिए समय की लंबी अवधि के के लिए बनाए रखा जा सकता है. Neuronal अग्रदूत साबित कोशिकाओं (NPCs) की पीढ़ी के लिए एक समान प्रोटोकॉल का अपवाद है कि centrifugation के बाद, ईबीएस बिना DMEM प्रयोग किया जाता है के साथ प्रयोग किया जाता है. कक्ष DMEM/F12 (01:03) में टी 25-B27 और EGF (20 एनजी / एमएल) के साथ पूरक बोतल neuropheres के गठन की अनुमति में चढ़ाया जाता है. NPCs अंतर करने के लिए, neurospheres laminin (10 स्नातकीय / एमएल) DMEM/F12 (01:03) N2 के साथ पूरक मध्यम में लेपित coverslips पर चढ़ाया जाता है. 3. प्रतिनिधि परिणाम स्वस्थ संस्कृतियों के 5 दिनों के बाद विगलन बाद महत्वपूर्ण वृद्धि और भेदभाव को दिखाने के लिए और आम तौर पर 10 दिनों (चित्रा 1) द्वारा अपने विकास में स्थिर होगा. इन संस्कृतियों के Immuncocytochemical धुंधला कई astrocytes (2A चित्रा) से पता चलता है और दोनों मानव और चूहे की प्राथमिक neuronal संस्कृतियों के लिए न्यूरॉन्स (चित्रा 2B). इस प्रोटोकॉल भी मुक्त अस्थायी (चित्रा 3A) neurospheres, जो फर्क शर्तों के तहत, उच्च गुणवत्ता मिश्रित संस्कृतियों (चित्रा 3B, सी) में परिणाम. NPCs के रूप में पीढ़ी के लिए उपयुक्त है चित्रा 1. Thawed जमे हुए मानव cortical ऊतक के सेल संस्कृतियों जमे हुए मानव cortical ऊतक ब्लॉक और पाली lysine लेपित coverslips पर चढ़ाया हुआ और 10 दिनों के लिए हो. 5 सेल विस्तार करके दिन स्पष्ट है और दिन से 10 confluency हासिल की है. स्केल पट्टी: 100 सुक्ष्ममापी. चित्रा 2. सेल संस्कृतियों के Immunocytochemical धुंधला हो जाना. (ए) संस्कृति glial मार्कर glial fibrillary अम्लीय प्रोटीन (GFAP, मोटी तीर) के साथ दाग रहे थे. (बी) न्यूरॉन्स neuronal मार्कर बीटा ट्यूबिलिन III (TIII, पतली तीर) के साथ पाया गया. (सी) दोनों मानव और चूहे संस्कृतियों संस्कृति में 10 दिनों के बाद प्रचुर मात्रा में glia और न्यूरॉन्स दिखा. प्राथमिक एंटीबॉडी: माउस (1:1000) विरोधी GFAP और खरगोश विरोधी TIII (1:1000). माध्यमिक एंटीबॉडी: विरोधी माउस 594 Alexa (1:500) और विरोधी खरगोश 488 Alexa (1:500). नाभिक धुंधला: Hoestch नीले (1:1000). स्केल पट्टी: 50 सुक्ष्ममापी. चित्रा 3. Neurospheres के सृजन (ए) जमे हुए ऊतक संसाधित किया गया था के रूप में ऊपर वर्णित है और neurospheres रूप प्रचार की अनुमति दी. (बी) Neurospheres कांच coverslips पर फर्क शर्तों के तहत चढ़ाया गया और 10 दिनों के लिए हो, neurosphere से दूर पलायन कोशिकाओं में जिसके परिणामस्वरूप. (सी) दोनों न्यूरॉन्स और astrocytes एक फर्क neurosphere के विस्तार हाशिये में मौजूद हैं. परमाणु counterstaining, प्राथमिक और माध्यमिक एंटीबॉडी चित्र में 2 के रूप में इस्तेमाल किया.

Discussion

Cryopreservation बैंक भविष्य में उपयोग के लिए कीमती मस्तिष्क के ऊतकों के नमूनों के लिए एक अवसर प्रदान करता है. यहाँ हम एक सरल लेकिन प्रभावी प्रोटोकॉल का वर्णन करने के लिए दोनों न्यूरॉन समृद्ध संस्कृतियों और जमे हुए मस्तिष्क के ऊतकों ब्लॉक से neuronal कोशिकाओं अग्रदूत उत्पन्न. यह किफायती प्रक्रिया पारंपरिक cryopreservation तकनीक है कि अधिक महंगी दर नियंत्रित फ्रीजर का उपयोग की लागत से बचा जाता है. प्रोटोकॉल व्यवहार्य neuronal संस्कृतियों के बाद विगलन की पीढ़ी के लिए एक तेजी से अभी तक प्रभावी साधन प्रदान करने के लिए ऊतक ब्लॉक फ्रीज द्वारा की अनुमति देता है है. पूरे जमने की प्रक्रिया के रूप में छोटा रूप में 20 मिनट लग सकते हैं. प्राथमिक neuronal संस्कृतियों के अलावा, इस विधि ऊतक ब्लॉक का उपयोग भी मुक्त अस्थायी neurospheres के रूप में हो NPCs उत्पन्न thawed जा सकता है. इस संबंध में, हमारे ठंड माध्यम सीरम की कमी सुनिश्चित करता है कि कोशिकाओं को एक undifferentiated राज्य में संरक्षित कर रहे हैं. फर्क शर्तों के तहत, neurospheres जमी ऊतक शो विस्तार और भेदभाव बहुत ताजा ऊतकों से उत्पन्न neurospheres करने के लिए तुलनीय दरों से उत्पादन किया.

Materials

Material Name	Tipo	Company	Catalogue Number	Comment
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)		Invitrogen	11995-073	High gluclose 1X
Bovine calf serum supplemented		HYCLONE	SH30072.03	For culture medium
Neurobasal-A Medium (1X), liquid		Invitrogen	1088-022
B27 Supplement		Invitrogen	17504-044	Supplement for Neurobasal medium
N2 Supplement		Invitrogen	17502-048	Supplement for Neurobasal medium
Trypsin (10X)		Cellgro	25-054CI	Tissue dissociation
Deoxyribonuclease 1 from bovine pancreas (DNase)		Sigma	D4527-30KU	Tissue dissociation
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) (10X)		GIBCO	14065	Cleaning tissue, washes, and freezing medium
Poly-L-Lysine- 500mg		Invitrogen	P2636	Substrate for adhesion of neuronal cells
antibiotic-antimycotic (100X), liquid		Invitrogen	15240-062	To prevent contamination
Large orifice pipette Tips (1-200 ul)		Fischer Scientific	02-681-141	To prevent shear stress to cells
Graduated pipette tips (101-1000 ul)		USA Scientific	1111-2721
21 G1 precision guide needles		Beckton Dickinson	305165	To clean tissue
10 ml pipette		USA Scientific	1071-0810	Individually wrapped
50 ml tubes		USA Scientific	926-9-04
Single edge razor blade		Smith Brand	67-0238	To chop tissue
60 x 15 mm polystyrene petri dish		USA Scientific	8609-0160	For general culture
100 x 15 mm polystyrene petri dish		USA Scientific	8609-0010	For cleaning tissue
Cryogenic box		NALGENE Labware	5026-1010
Freezing container		NALGENE Labware	5100-0001	“Mr. Frosty”
2.0 ml cryogenic vials		NALGENE Labware	5012-0020
DMSO		Fischer Scientific	D128-500	For freezing medium
Ethanol 200 proof		Sigma	E7023	For sterilizing razor blade