Isolamento e Expansão do Rato Adulto células-tronco neurais utilizando o ensaio Neurosphere

Resumo

Este protocolo video demonstra o método de ensaio neurosphere para gerar e expandir as células-tronco neurais adultas da região periventricular do mouse, e fornece informações técnicas para garantir um pode conseguir culturas neurosphere reprodutível.

Resumo

Isolamento e expansão do suposto células-tronco neurais (NSCs) do cérebro adulto murino foi primeiramente descrita por Reynolds e Weiss, em 1992, empregando um sistema de cultura quimicamente definido sem soro conhecido como o ensaio neurosphere (NSA). Neste ensaio, a maioria dos tipos de células diferenciadas morrer dentro de alguns dias de cultura, mas uma pequena população de células precursoras do fator de crescimento sensível sofrem proliferação ativa na presença de fator de crescimento epidérmico (EGF) e / fator de crescimento básico de fibroblastos (bFGF). Essas células formam colônias de células indiferenciadas chamada neurospheres, que por sua vez podem ser repicadas para expandir o pool de células-tronco neurais. Além disso, as células podem ser induzidas a se diferenciar, gerando os três principais tipos de células dos neurônios do SNC, ou seja, astrócitos e oligodendrócitos. Este teste fornece uma ferramenta valiosa para fornecer uma fonte consistente e renováveis ​​de precursores indiferenciados CNS, que poderiam ser usados ​​para estudos in vitro e também para fins terapêuticos.

Este vídeo demonstra o método NSA para gerar e expandir NSCs da região do rato adulto periventricular, e fornece informações técnicas para garantir um pode conseguir culturas neurosphere reprodutível. O procedimento inclui a colheita do cérebro do rato adulto, micro-dissecção da região periventricular, preparação de tecidos e cultura na NSA. O tecido colhido é o primeiro quimicamente digerida com tripsina-EDTA e, em seguida mecanicamente dissociado em meio NSC para alcançar uma suspensão única célula e, finalmente, banhado na NSA. Após 7-10 dias de cultura, o resultado primário neurospheres estão prontos para a subcultura para alcançar a quantidade de células necessárias para futuros experimentos.

Protocolo

Parte 1: Basic criado antes de prosseguir para dissecção:

1. Volume apropriado de meio NSC completo é preparado pela mistura NeuroCult NSC Basal Medium e Suplementos NeuroCult NSC Proliferação na proporção 9:1, respectivamente. NSC médio também podem ser feitos em laboratório com base na composição do meio de crescimento NSC publicados na literatura ¹. Se o seu laboratório não tem muita experiência em fazer média, é altamente recomendável para uso médio comercialmente disponível que tem sido a qualidade controlada para NSCs crescimento antes de serem vendidos (que é o caso de NeuroCult, Technolgies Stem Cell).
2. O meio é aquecido em banho-mar....

Discussão

O ensaio neurosphere ² ganhou ampla atenção na comunidade de pesquisa não só para o isolamento e estudo de NSCs do CNS ^05/04, mas também para o isolamento de outros tipos de células-tronco a partir de tecidos putativa numerosos, como os de mama ⁶ e ⁷ e coração para a identificação de câncer de mama, cérebro e células-tronco tumor de cólon ^09/08 sugerindo que este sistema de cultura pode ser aplicado a um número de somáticas e populações precursor tumor de células po.......

Materiais

* Para fazer HEM, misture 110L pacote de MEM and160ml de HEPES 1M e obter um volume de 8,75 L com água destilada. Definir o pH final para 7,4 e armazená-lo a 4 ° C.