एक नकारात्मक के लिए चयन मार्कर का विकास एटामोइबा हिस्टोलिटिका</em

Summary

हम में एक नकारात्मक चयन प्रणाली के विकास रिपोर्ट<em> ई. हिस्टोलिटिका</em> एक chimeric प्रोटीन की ट्रांसजेनिक अभिव्यक्ति (FCU1) और prodrug 5 fluorocytosine के साथ चयन पर आधारित है. FCU1 प्रोटीन खमीर साइटोसिन deaminase और phosphoribosyltransferase uracil के एक संलयन है. FCU1 की अभिव्यक्ति में वृद्धि हुई परिणामस्वरूप<em> ई. हिस्टोलिटिका</em5 – fluorocytosine की ओर संवेदनशीलता.

Abstract

एटामोइबा हिस्टोलिटिका amebiasis की प्रेरणा का एजेंट है और विश्व की जनसंख्या का 10% अप करने के लिए संक्रमित है . आणविक तकनीक है कि ऊपर और जीन अभिव्यक्ति के नीचे विनियमन सक्षम है stably बनाए रखा plasmids के अभिकर्मक पर भरोसा करते हैं. जबकि इन एटामोइबा विषैलापन कारकों के बारे में हमारी समझ वृद्धि हुई है, क्षमता जीनोम, जो रिवर्स आनुवंशिकी प्रयोगों, एक महत्वपूर्ण लाभ इस परजीवी के अध्ययन में किया जाएगा अनुमति होगी exogenous डीएनए में एकीकृत करने के लिए. इस जीव द्वारा प्रस्तुत चुनौतियों मुताबिक़ पुनर्संयोजन घटनाओं और कठिनाई ट्रांसफ़ेक्ट ट्रोफोजोइट्स से episomal प्लास्मिड डीएनए इलाज के लिए चयन करने में असमर्थता शामिल हैं. exogenous डीएनए, ट्रोफोजोइट्स जिसमें एक सदाशयी जीनोमिक एकीकरण घटना हुई है की पहचान करने में एक प्रमुख समस्या के एक उच्च पृष्ठभूमि में बाद में परिणाम है. हम एक नकारात्मक चयन एक खमीर साइटोसिन deaminase और phosphoribosyl transferase कल्पना (FCU1) 5 fluorocytosine prodrug (5 एफसी) के साथ चयन और uracil के ट्रांसजेनिक अभिव्यक्ति पर आधारित प्रणाली के विकास रिपोर्ट. FCU1 एंजाइम विषाक्त 5 fluorouracil और 5 fluorouridine – 5'-monophosphate ई. में गैर विषैले 5 एफसी धर्मान्तरित हिस्टोलिटिका FCU1 व्यक्त लाइनों के लिए 30 गुना अधिक नियंत्रण तनाव की तुलना में prodrug के प्रति संवेदनशील होना पाया गया.

Protocol

1. FCU एटामोइबा हिस्टोलिटिका में नकारात्मक चयन प्रणाली वेक्टर नियंत्रण (/ HM1 pKT3M) लाइन और प्रयोगात्मक लाइन (HM1/pKT3M-FCU1) पहले से वर्णित तकनीकों 1,2 द्वारा उत्पन्न किया गया. बीज T-25 बोतल में शेयर ट्यूब से अध्ययन के तहत लाइनों और बनाए रखने के TYI-S-33 3 मध्यम में उचित एंटीबायोटिक (12 μg / एमएल G418) जोड़कर चयन. बोतल विकास के 16-18 घंटे के बाद 37 पर 70-80% मिला हुआ होना चाहिए डिग्री सेल्सियस गर्म मध्यम TYI-S-33 में 5 Fluorocytosine (5 एफसी, सिग्मा) के एक ताजा 50mm शेयर समाधान तैयार करें. भंवर कड़ाई से कई मिनट के लिए 5 एफसी पूरी तरह से भंग करने के लिए. फ़िल्टर बाँझ 0.22 फिल्टर सुक्ष्ममापी के माध्यम से गुजर द्वारा शेयर समाधान. बर्फ पर 3-5 मिनट के लिए बोतल रखकर 200xg पर कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए centrifuging कोशिकाओं का संग्रह द्वारा हार्वेस्ट ट्रोफोजोइट्स. ताजा TYI मध्यम में गोली Resuspend और कोशिकाओं गिनती. एक ठेठ प्रयोग के डिजाइन 1 एमएल अंतिम मात्रा में एक 48 अच्छी तरह से थाली के 0.5 x 10 4 अच्छी तरह से प्रति कोशिकाओं का उपयोग करता है, और प्रत्येक परीक्षण हालत के लिए तीन प्रतियों को दोहराता है. इसके अलावा, फ्लोरोसेंट माप की सुविधा के लिए, समय बिंदु प्रति प्रत्येक तनाव के लिए एक अलग प्लेट में प्रयोग किया जाता है. बीज 0.5 x 10 प्रत्येक 5 एफसी परीक्षण तीन प्रतियों में, एकाग्रता के लिए अच्छी तरह से प्रति 4 कोशिकाओं . TYI माध्यम से एंटीबायोटिक चयन दबाव बनाए रखें. अब 5 एफसी शेयर समाधान और प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए ट्रोफोजोइट्स के लिए आवश्यक राशि जोड़. 37 पर एक anaerobic बैग में प्लेटें सेते डिग्री सेल्सियस 2. चयन क्षमता का निर्धारण 2 मिलीग्राम / एमएल सेल DMSO में ट्रैकर हरी CMFDA (Invitrogen) के शेयर समाधान तैयार है. बनाने के लिए काम कर समाधान शेयर सीरम मुक्त TYI माध्यम से 1000 गुना पतला. मध्यम trophozoite संस्कृति प्लेटों से पूरी तरह से निकालें 150 μL सीरम मुक्त TYI युक्त CMFDA के साथ की जगह. 37 पर ऊष्मायन जारी रखें ° सी 1 घंटे के लिए. कुओं से डाई समाधान निकालें और Spectramax M2 microplate spectrofluorometer में थाली पढ़ें. उत्तेजना तरंग दैर्ध्य 492 एनएम पर सेट किया जाना चाहिए और प्रतिदीप्ति उत्सर्जन 517 एनएम पर पढें. परीक्षण transfectants बनाम नियंत्रण कक्ष के लिए प्रतिदीप्ति मूल्यों की तुलना करें. प्रत्येक समय अंतराल पर प्लेटें पढ़ना जारी रखें. प्रत्येक थाली में उपयुक्त (TYI केवल) सकारात्मक और नकारात्मक (25 μg / एमएल hygromycin) नियंत्रण कुओं का प्रयोग करें. 3. प्रतिनिधि परिणाम ई. हिस्टोलिटिका transfectants codon अनुकूलित पुनः संयोजक FCU1 (चित्रा 1) के मजबूत अभिव्यक्ति से पता चला जब इस प्रोटोकॉल सही ढंग से पीछा किया जाता है ई. के चुनिंदा उन्मूलन में यह परिणाम है. हिस्टोलिटिका FCU1 0.5 मिमी 5 – fluorocytosine की उपस्थिति में व्यक्त की कोशिकाओं. नियंत्रण कोशिकाओं, इसके विपरीत पर सामान्य रूप से विकसित 5 – एफसी के 5 मिमी एकाग्रता और 72 और 96 बजे के बीच संगम तक पहुँचने के लिए जारी (2 चित्रा). 48 बजे FCU1 कोशिकाओं को ले जाने को पूरी तरह जब इलाज कुओं एक खुर्दबीन के नीचे देखा जाता है lysed हैं. ये भी प्रतिदीप्ति कमी आई दिखाने के लिए जब महत्वपूर्ण डाई CMFDA, जो मात्रात्मक अध्ययन नमूनों की बड़ी संख्या (आंकड़ा 2 बी) को शामिल में प्रयोग किया जाता है के साथ दाग. FCU1/5-FC प्रणाली ई. के लिए एक प्रभावी और शक्तिशाली नकारात्मक चयन उपकरण है हिस्टोलिटिका ट्रोफोजोइट्स. चित्रा 1. ई. के सृजन हिस्टोलिटिका HM1 नकारात्मक चयन मार्कर व्यक्त transfectants (क) FCU1 पुनः संयोजक प्रोटीन एक पश्चिमी विरोधी ग Myc एंटीबॉडी (शीर्ष पैनल) का उपयोग कर धब्बा पर खोजा गया था. जैसी कि उम्मीद थी, एक 42kDa बैंड FCU transfectants से कुल lysate में हो सकता है (एक तीर द्वारा दिखाया गया है) सकता है लेकिन अकेले वेक्टर नियंत्रण transfectants में नहीं पाया. वह नीचे के पैनल से पता चलता है एक लोडिंग नियंत्रण के रूप में एक ही धब्बा विरोधी actin एंटीबॉडी के साथ जांच. (ख) मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर के परिणाम FCU1 विशिष्ट lgl4 नियंत्रण के लिए सामान्यीकृत mRNA की अभिव्यक्ति दिखा. चित्रा 2 में इन विट्रो ई. की दवा संवेदनशीलता हिस्टोलिटिका नकारात्मक चयन मार्कर व्यक्त transfectants (क) नियंत्रण transfectants और (ख) FCU1 व्यक्त transfectants 48-अच्छी तरह से थाली में सभ्य जीवन रक्षा घटता . कोशिकाओं की बढ़ती सांद्रता के उपस्थिति में बड़े हो रहे थे prodrug-5-fluorocytosine, सेल अस्तित्व CMFDA धुंधला द्वारा प्रत्येक समय अंतराल पर मात्रा निर्धारित किया गया था के रूप में एक्स अक्ष पर चिह्नित. Y-अक्ष प्रतिदीप्ति इकाइयों का प्रतिनिधित्व करता है और जीवित सेल की आबादी का एक सीधा प्रतिबिंब है. कृपया ध्यान दें कि FCU1 व्यक्त transfectants 0.5mm prodrug एकाग्रता पर नियंत्रण की तुलना में महत्वपूर्ण संवेदनशीलता से पता चला. कोई कोशिकाओं 120h समय बिंदु पर इन कुओं में कॉम के रूप में मनाया गयामिला हुआ खुर्दबीन के नीचे इसी नियंत्रण कुओं (नहीं दिखाया डेटा है) में देखा वृद्धि के मुकाबले. Hygro 25μg / एमएल एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया hygromycin अर्थ.

Discussion

यद्यपि वहाँ एटामोइबा आणविक जैविक उपकरण में पर्याप्त प्रगति की गई है वहाँ कोई मौजूदा तरीकों को हटाने ^या 4 जीन को बाधित करने के लिए उपलब्ध हैं. जीन विशिष्ट अभिव्यक्ति की पछाड़ना सड़क के ढालवाँ ⁵ RNAs, छोटे दखल शाही सेना ⁶ के उपयोग द्वारा हासिल किया गया है और bacterially dsRNA ⁷ व्यक्त. हालांकि इन तरीकों संबंधित लक्ष्य जीन के लिए प्रभावी, जबकि महंगा रसायन, एंटीबायोटिक दवाओं के खिलाफ निरंतर चयन और निरंतर प्रत्यावर्तन के उच्च घटना के समय पर होने वाली (एलिसिया ^Linford, व्यक्तिगत संचार) 8 कारण मान्यता के लिए जरूरत के उपयोग सहित कई सीमाएं हैं.

एटामोइबा में कोई प्लाज्मिड को दोहराने के रूप में वहाँ जाहिरा तौर पर ^{डीएनए} प्रतिकृति 9 की मूल के लिए एक सख्त अनुक्रम आवश्यकता नहीं है, कर सकते हैं और ट्रांसफ़ेक्ट तो एक बार, यह आमतौर पर एक प्लाज्मिड इलाज के लिए मुश्किल है. यह संभव पुनर्संयोजन और जीन पीटा प्रयोगों में बरकरार plasmids के उपयोग की सीमा. नकारात्मक चयन मार्करों तरीकों लक्ष्यीकरण के रूप में वे पुनः संयोजक subpopulations को खत्म करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है जीन के प्रमुख घटक हैं. हम सफलतापूर्वक एक codon व्यक्त की है एटामोइबा हिस्टोलिटिका में FCU1 जीन अनुकूलित और एक नकारात्मक चयन मार्कर के रूप में अपनी क्षमता का परीक्षण किया. इस जीन संलयन आत्मघाती मानव ट्यूमर कोशिकाओं के जीन थेरेपी के लिए इस्तेमाल किया गया है और विषाक्त बहाव शाही सेना और डीएनए ^{संश्लेषण} 10 के निषेध में जिसके परिणामस्वरूप उत्पादों में prodrug 5-एफसी metabolizes है. FCU1 हाल ही में किया गया है प्लाज्मोडियम, एक और प्रोटोजोआ परजीवी में एक नकारात्मक चयन मार्कर के रूप में इस्तेमाल किया प्लाज्मोडियम berghei FCU1 व्यक्त कोशिकाओं 5 – एफसी के साथ लगभग 1000 गुना अधिक इन विट्रो में और vivo उपचार में prodrug के प्रति संवेदनशील होना पाया गया के 99.9% से अधिक को मार डाला एरिथ्रोसाइटिक चरण ¹¹ मलेरिया के माउस मॉडल में पुनः संयोजक परजीवी संक्रमण ई. . हिस्टोलिटिका FCU1 व्यक्त कोशिकाओं पी. में मनाया संवेदनशीलता के विपरीत में केवल एक 30 गुना वृद्धि हुई है 5 – एफसी prodrug संवेदनशीलता से पता चला है berghei. इस के लिए संभावित कारणों में वृद्धि मध्यम विषाक्त चयापचयों के साथ प्रतिस्पर्धा में उपलब्ध nucleotides के बड़े पूल हो सकता है.
दोनों पी. berghei और पी. फाल्सीपेरम FCU1 मार्कर लक्षित जीन विघटन में इस्तेमाल किया गया है. ^11,12 अध्ययन. हम एटामोइबा जीनोम का उपयोग मुताबिक़ पुनर्संयोजन में हेरफेर करने के उद्देश्य. FCU1/5-FC नकारात्मक चयन प्रणाली के सत्यापन के इस लक्ष्य की दिशा में एक महत्वपूर्ण कदम है.

Materials

Material Name	Tipo	Company	Catalogue Number	Comments
TYI-S-33 medium		ATCC		Reference included in the text
5-Fluorocytosine		Sigma	F7129
Cell tracker green CMFDA		Invitrogen	C2925
Spectra Max M2 plate-reader		Molecular Devices