Vi rapporterar utvecklingen av ett negativt urval system<em> E. histolytica</em> Bygger på transgena uttryck av en chimär protein (FCU1) och urval med prodrug 5-fluorocytosine. Den FCU1 protein är en blandning av jäst cytosin deaminas och uracil fosforibosyltransferas. Redovisning av FCU1 resulterat i ökad<em> E. histolytica</em> Känslighet för 5-fluorocytosine.
Entamoeba histolytica är smittämnen av amebiasis och infekterar upp till 10% av världens befolkning. Den molekylära tekniker som har gjort det möjligt för upp-och nedreglering av genuttryck lita på transfektion av stabilt kvar plasmider. Även om dessa har ökat vår förståelse av Entamoeba virulensfaktorer, till kapaciteten integrera exogena DNA i arvsmassan, vilket skulle ge omvänd genetik experiment, skulle vara en betydande fördel i studiet av denna parasit. De utmaningar som denna organism inkluderar oförmåga att välja för homolog rekombination händelser och svårigheter att bota episomal plasmid DNA från transfekterade trophozoites. Det senare resulterar i en hög bakgrund av exogena DNA, ett stort problem i identifieringen av trophozoites som en bona fide genomisk integrering händelse har inträffat. Vi rapporterar utvecklingen av ett negativt urval baserat på transgena uttryck för en jäst cytosin deaminas och uracil fosforibosyl transferas chimär (FCU1) och urval med prodrug 5-fluorocytosine (5-FC). Den FCU1 enzym omvandlar giftfria 5-FC till giftiga 5-fluorouracil och 5-fluorouridin-5'-monofosfat. E. histolytica som uttrycker FCU1 befanns vara 30 gånger mer känsliga för prodrug jämfört med kontrollgruppen påfrestningar.
Även om det har gjorts betydande framsteg inom Entamoeba molekylärbiologiska verktyg Det finns inga aktuella metoder tillgängliga för att ta bort eller störa gener 4. ÖVERVÄLDIGANDE av genen specifikt uttryck har uppnåtts genom att använda hårnålen RNA 5, små störande RNA 6 och bacterially uttryckt dsRNA 7. Men dessa metoder medan effektiva för respektive mål gener har flera begränsningar, inklusive användningen av dyra kemikalier, kontinuerliga urval mot antibiotika och behovet av ständig validering på grund av den höga förekomsten av reversion som inträffar över tiden (Alicia Linford, personlig kommunikation) 8.
Alla plasmiden kan replikera i Entamoeba eftersom det uppenbarligen inte en strikt sekvens krav på ursprung av DNA replikation 9, och så när transfekterade, det oftast är svårt att bota en plasmid. Detta begränsar eventuell användning av intakt plasmider i rekombination och gen-knockout experiment. Negativa markörerna är viktiga komponenter för riktad genmodifiering metoder som de kan användas för att eliminera rekombinant subpopulationer. Vi har framgångsrikt uttryckt en kodon optimerad FCU1 gen i Entamoeba histolytica och testat dess potential som en negativ markör. Denna gen fusion har använts för självmord genterapi på mänskliga tumörceller och metaboliserar prodrug 5-FC in giftiga produkter i senare led vilket resulterar i hämning av RNA-och DNA-syntes 10. FCU1 har nyligen använts som en negativ markör i Plasmodium, en annan protozo parasit. Plasmodium berghei celler som uttrycker FCU1 befanns vara nästan 1000 gånger mer känsliga för prodrug in vitro och in vivo-behandling med 5-FC dödade över 99,9% av infektera rekombinant parasiter i erytrocyt-stegs musmodell av malaria 11. E. histolytica celler som uttrycker FCU1 visade bara en 30-faldig ökad känslighet för prodrug 5-FC i kontrast till den känslighet som observerats i P. berghei. Möjliga orsaker till detta kan vara stor pool av nukleotider som finns i tillväxten mediet konkurrerar med de toxiska metaboliter.
I båda P. berghei och P. falciparum den FCU1 markör har använts i riktade genen störningar. studier 11,12. Vi strävar efter att manipulera Entamoeba genomet med hjälp av homolog rekombination. Valideringen av FCU1/5-FC negativt urval är ett viktigt steg mot detta mål.
The authors have nothing to disclose.
Vi vill tacka Dr Philippe Erbs för att förse oss med den sekvens av FCU1 genen. Detta arbete stöddes av NIH bidrag AI 26.649.
Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comments |
TYI-S-33 medium | ATCC | Reference included in the text | ||
5-Fluorocytosine | Sigma | F7129 | ||
Cell tracker green CMFDA | Invitrogen | C2925 | ||
Spectra Max M2 plate-reader | Molecular Devices |