Respirometric окислительного фосфорилирования в оценке Saponin-проницаемыми Сердечные волокна
Summary
Saponin-проницаемыми волокна подготовки в сочетании с respirometric окислительного фосфорилирования обеспечивает анализ интегративной оценки митохондриальной функции. Митохондриальная дыхания в физиологических и патологических состояний могут отражать различные регуляторных влияний в том числе митохондриальных взаимодействий, морфологии и биохимии.
Abstract
Исследование функции митохондрий, представляет собой важный параметр сердечной физиологии митохондрий принимают участие в энергетическом обмене, окислительный стресс, апоптоз, старение, митохондриальная encephalomyopathies и токсичности препаратов. Учитывая это, технологий для измерения сердечной функции митохондрий, пользуются спросом. Один из методов, который использует комплексный подход для оценки митохондриальной функции respirometric окислительного фосфорилирования (OXPHOS) анализа.
Принцип оценки respirometric OXPHOS сосредоточена вокруг измерения концентрации кислорода использованием электрода Кларка. Как проницаемыми расслоение потребляет кислород, концентрация кислорода в закрытой камере снижается. Использование выбранный субстрат-ингибитор-разобщающий агент протоколов титрования, электроны предоставляются участки, специально предназначенные электрон-транспортной цепи, позволяющие оценки митохондриальной функции. До respirometric анализ митохондриальной функции, механические и химические методы подготовительных используются для permeabilize сарколеммы мышечных волокон. Химическая пермеабилизации работают сапонин выборочно перфорировать мембраны клетки, сохраняя при этом сотовая архитектура.
Эта статья полностью описывает шаги, связанные с подготовкой сапонин кожей сердечных волокон для измерения потребления кислорода для оценки митохондриальной OXPHOS. Кроме того, устранение неполадок консультации, а также специфических субстратов, ингибиторов и разобщители, которые могут быть использованы для определения функции митохондрий в определенных участков электрон-транспортной цепи предоставляются. Важно отметить, что описанный протокол может быть легко применить к сердечной и скелетной ткани различных моделей животных и человека образцов.
Protocol
Discussion
Сапонин-проницаемыми сердечной техника волокна предлагает уникальный компромисс между в пробирке и в естественных оценки митохондриальной потребления кислорода OXPHOS. Преимущества этого метода включают повышенную физиологическую значимость по сравнению с изолированными м…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Работа выполнена при поддержке Канадского института исследований в области здравоохранения и Геном Канада. JS имеет зарплату поддержки награды от Альберта Heritage Foundation медицинских исследований сердца и инсульта фонда Канады и Канадской Ассоциации Диабета. Лаборатория хотел бы выразить признательность технической помощи инструментов Oroboros при приобретении сапонин-проницаемыми волокна техники.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 100% Ethanol | Fisher Scientific | HC600 | ||
| 70% Ethanol | Fisher Scientific | HC-1000 | ||
| Adenosine 5′-diphosphate monopotassium salt dihydrate (ADP) | Sigma | A5285 | ||
| Albumin from bovine serum essentially fatty acid–free | Sigma | A-6003 | ||
| Antimycin A | Sigma | A8674 | ||
| Ascobic acid | Sigma | A4403 | ||
| Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate (ATP) | Sigma | A2383 | ||
| Atractyloside | Sigma | A6882 | ||
| Calcium carbonate | Sigma | C4830 | ||
| Carbonyl cyanide p-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP) | Sigma | C2920 | ||
| Cytochrome c | Sigma | C7752 | ||
| Digitonin | Sigma | D141 | ||
| Dithiothreitol | Sigma | D9779 | ||
| Ethylene glycol-bis-(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid (EGTA) | Sigma | E4378 | ||
| Glutamic acid | Sigma | 27647 | ||
| HEPES | Sigma | H4034 | ||
| Imidazole | Sigma | I5513 | ||
| Ketamine | Pfizer | Ketaset | ||
| Lactobionic acid | Sigma | 153516 | ||
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma | M9272 | ||
| Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2∙6H2O) | Sigma | M9272 | ||
| Malic acid | Sigma | M1000 | ||
| MES | Sigma | M3671 | ||
| N,N,N’,N’-Tetramethyl- pphenylenediamine Dihydrochloride (TMPD) | Sigma | T3134 | ||
| Oligomycin | Sigma | O4876 | ||
| Phosphocreatine | Sigma | P7936 | ||
| Potassium Chloride | Sigma | P9541 | ||
| Potassium Hydroxide | Sigma | P5958 | ||
| Potassium cyanide | Fluka | 60178 | ||
| Potassium phosphate monobasic | Sigma | P5655 | ||
| Rotenone | Sigma | R8875 | ||
| Saponin | Sigma | 47036 | ||
| Sodium Pentobarbital | Ceva Sante Animale | 1715 138 | Conc. 54.7 mg/ml | |
| Sodium pyruvate | Sigma | P2256 | ||
| Succinic acid | Sigma | S3674 | ||
| Sucrose | Sigma | S7903 | ||
| Taurine | Sigma | T8691 | ||
| Xylazine | Bayer | Rompun | ||
| ddH2O | ||||
| Ice | ||||
| Oroboros Oxygraph-2k | Oroboros Instruments | |||
| Kimwipes | VWR | 21905-026 | ||
| 15ml polypropylene centrifuge tubes | VWR | 89004-368 | ||
| 50ml polypropylene centrifuge tubes | VWR | 89004-364 | ||
| Straight Jewelers Forceps | George Tiemann & Co. | 160-50B | ||
| Curved Jewelers Forceps | George Tiemann & Co. | 160-57B | ||
| Straight Surgery Scissors | George Tiemann & Co. | 105-402 | ||
| Sterile Surgical Blade | VWR | BD371610 | ||
| 0.45-μm Syringe filters | VWR | CA28145-485 | ||
| pH meter | VWR | CA11388-308 | ||
| Glass Petri dishes | VWR | 89000-300 | ||
| 12-well Polystyrene Tissue Culture Plates | VWR | 82050-926 | ||
| Plate Stirrer | VWR | 97042-594 | ||
| Fisherbrand Microbars | Fisher Scientific | 14-511-67 | ||
| Weigh Scale | VWR | CA11278-162 | ||
| 10μl Hamilton Micro Syringe | Fisher Scientific | 14-815-1 | ||
| 25μl Hamilton Micro Syringe | Fisher Scientific | 14-824-7 | ||
| 50μl Hamilton Micro Syringe | Fisher Scientific | 14-824-5 | ||
| Nalgene Squeeze Bottles | Wilkem Scientific | LNA2407-1000 | ||
| Polystyrene Weighing Dishes | VWR | 89106-750 | ||
| Dissecting Microscope | Olympus |
Referências
- Saks, V. A., Veksler, V. I., Kuznetsov, A. V. Permeabilized cell and skinned fiber techniques in studies of mitochondrial function in vivo. Mol Cell Biochem. 184, 81-100 (1998).
- Gnaiger, E., Kuznetsov, A. V., Schneeberger, S., Heldmaier, G., Klingenspor, M. Mitochondria in the cold. Life in the Cold. , 431-442 (2000).
- Rasmussen, H. N., Rasmussen, U. F. Oxygen solubilities of media used in electrochemical respiration measurements. Anal Biochem. 319, 105-113 (2003).
- Visscher, G. D. e., Rooker, S., Jorens, P. Pentobarbital fails to reduce cerebral oxygen consumption early after non-hemorrhagic closed head injury in rats. J Neurotrauma. 22, 793-806 (2005).
- Kuznetsov, A. V., Veksler, V., Gellerich, F. N. Analysis of mitochondrial function in situ in permeabilized muscle fibers, tissues and cells. Nat Protoc. 3, 965-976 (2008).
- Gnaiger, E. Oxygen conformance of cellular respiration. A perspective of mitochondrial physiology. Adv Exp Med Biol. 543, 39-55 (2003).
- Gnaiger, E. Capacity of oxidative phosphorylation in human skeletal muscle: new perspectives of mitochondrial physiology. Int J Biochem Cell Biol. 41, 1837-1845 .
- Sena, S., Hu, P., Zhang, D. Impaired insulin signaling accelerates cardiac mitochondrial dysfunction after myocardial infarction. J Mol Cell Cardiol. 46, 910-918 (2009).
- Boudina, S., Sena, S., O’Neill, B. T. Reduced mitochondrial oxidative capacity and increased mitochondrial uncoupling impair myocardial energetics in obesity. Circulation. 112, 2686-2695 (2005).
- Lenaz, G., Genova, M. L. Structure and organization of mitochondrial respiratory complexes: a new understanding of an old subject. Antioxid Redox Signal. 12, 961-1008 .
- Lemieux, H., Hoppel, C. L. Mitochondria in the human heart. J Bioenerg Biomembr. 41, 99-106 (2009).
- O, . Retarded diffusion of ADP in cardiomyocytes: possible role of mitochondrial outer membrane and creatine kinase in cellular regulation of oxidative phosphorylation. Biochim Biophys Acta. 1144, 134-148 (1993).
- Endo, M., Kitazawa, T., Morad, M. E-C coupling studies in skinned cardiac fibers. Biophysical Aspects of Cardiac Muscle. , 307-327 (1978).
- Veksler, V. I., Kuznetsov, A. V., Sharov, V. G. Mitochondrial respiratory parameters in cardiac tissue: a novel method of assessment by using saponin-skinned fibers. Biochim Biophys Acta. 892, 191-196 (1987).
- Bangham, A. D., Horne, R. W., Glauert, A. M. Action of saponin on biological cell membranes. Nature. , 196-952 (1962).
- Daum, G. Lipids of mitochondria. Biochim Biophys Acta. 822, 1-42 (1985).
- Milner, D. J., Mavroidis, M., Weisleder, N. Desmin cytoskeleton linked to muscle mitochondrial distribution and respiratory function. J Cell Biol. 150, 1283-1298 (2000).
- Skladal, D., Sperl, W., Schranzhofer, R., Skladal, E., Gellerich, F., Wyss, M. Preservation of mitochondrial functions in human skeletal muscle during storage in high energy preservation solution (HEPS). What is Controlling Life?. , 268-271 (1994).
- Kuznetsov, A. V., Wiedemann, F. R., Winkler, K. Use of saponin-permeabilized muscle fibers for the diagnosis of mitochondrial diseases. Biofactors. 7, 221-223 (1998).
- Gnaiger, E., Dykens, J., Will, Y. Polarographic oxygen sensors, the oxygraph and high-resolution respirometry to assess mitochondrial function. Drug-Induced Mitochondrial Dysfunction. , 327-352 (2008).
