Microtiter Bulaşık Biyofilm Oluşumu Testi
Summary
Tahlil, bakteri ve mantar erken biyofilm oluşumunu ölçmek için hızlı bir yöntem açıklanmıştır. Bu yöntem mikrotiter plate mikrobiyal biyofilm oluşumu için alt tabaka olarak kullanır ve biyofilm kristal viyole suşu kullanılarak görüntülenmiştir. Tahlil ya erken biyofilm oluşumu için bir kalitatif veya kantitatif sağlar.
Abstract
Biyofilmler, tıbbi, endüstriyel ve doğal ortamlarda bulunabilir yüzeylere bağlı topluluklar, mikrop. Aslında, bir biyofilm yaşam muhtemelen çoğu ortamda mikropların büyüme baskın modu temsil eder. Olgun biyofilm birkaç farklı özellikleri var. Biyofilm mikropların genellikle toplum yapısı ve koruma sağlayan bir ekstrasellüler matriks ile çevrilidir. Bir biyofilm büyüyen Mikroplar genellikle sıvı dolu kanallar ile çevrili macrocolonies (binlerce hücre içeren) oluşan karakteristik bir mimariye sahip. Biyofilm yetiştirilen mikropların da, klinik olarak ilgili antibiyotik gibi antimikrobiyal ajanların bir dizi karşı direniş için kötü üne sahip.
Mikrotiter çanak testi, biyofilm oluşumu erken aşamalarında çalışma için önemli bir araçtır ve bu testte de, mantar biyofilm oluşumunu incelemek için kullanılmış olmasına rağmen, bakteriyel biyofilm çalışma için öncelikle tatbik edilmiştir. Bu testte, statik, toplu büyüme koşulları kullanır, çünkü genellikle akış hücresi sistemleri ile ilişkili olgun biyofilm oluşumu için izin vermez. Ancak, tahlil ve ekstrasellüler polisakkarit üretimi genler gibi biyofilm oluşumu başlangıcında (yani, kamçı, pili, adhezinleri siklik-di-GMP bağlayıcı ve metabolizmasında yer alan enzimler) için gerekli birçok faktör tespit etkili olmuştur. Ayrıca, yayınlanan iş mikrotiter yemekleri yetiştirilen biyofilm, bağışıklık sistemi etkileyiciler böyle bir antibiyotik hoşgörü ve direnç olgun biyofilm bazı özelliklerini geliştirmek olduğunu gösterir.
Bu basit mikrotiter çanak tahlil duvar ve / veya bir mikrotiter çanak alt bir biyofilm oluşumunu sağlar. Testin yüksek verim doğa genetik ekranlar için yararlı yanı sıra çeşitli büyüme koşulları altında birden fazla suşları tarafından test biyofilm oluşumu yapar. Bu testte Türevleri erken biyofilm oluşumu dahil olmak üzere, mikropların geniş bir yelpazede, değerlendirmek için kullanılan, ancak pseudomonads, Vibrio cholerae, Escherichia coli, stafilokoklar, enterokoklar, mikobakteriler ve mantarlar , sınırlı olmuştur.
Burada açıklanan protokol, model organizma Pseudomonas aeruginosa tarafından biyofilm oluşumunu incelemek için bu testin kullanımı üzerinde durulacak. Bu testte, biyofilm oluşumu ölçüde boya kristal viyole (CV) kullanılarak ölçülür. Ancak, diğer kolorimetrik ve metabolik lekeleri sayısı ölçümü için mikrotiter plate assay kullanarak biyofilm oluşumu bildirilmiştir. Mikrotiter plate testinin kolaylığı, düşük maliyet ve esneklik biyofilm çalışma için kritik bir araç haline getirmiştir.
Protocol
Discussion
Bu yöntem, çok çeşitli mikrobiyal türlerin kullanım için modifiye edilebilir. Non-motil mikropların genellikle kuyuların dibine bağlı hareketli mikropların genellikle, duvarlar ve / veya kuyuların dipleri bağlı. Biyofilm oluşumu (yani, büyüme ortamı, sıcaklığı, kuluçka süresi) için optimal koşulları her mikrop için ampirik olarak tespit edilmelidir. Ben her tür ya da durum (4-8) birden fazla performans için her bir plaka üzerinde bir negatif kontrol çoğaltır ve olumlu bir kontrolü de …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Sherry Kuçma, Pete Newell ve Robert Shanks Şekil 1 görüntüleri sağlamak için teşekkür ederim. Bu çalışma GAO, Ulusal Sağlık Enstitüsü, hibe R01AI083256 tarafından desteklenen
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 1 X M63 | Prepare as a 5X M63 stock by dissolving 15g KH2PO4, 35g K2HPO4 and 10g (NH4)2SO4 in 1 L of water. This stock does not need to be autoclaved and can be stored at room temperature. Dilute 5X stock 1:5, autoclave, cool, then add the desired components. | |||
| KH2PO4 | Fisher | P285-500 | ||
| K2HPO4 | Fisher | P288-500 | ||
| (NH4)2SO4 | Sigma | A5132 | ||
| Magnesium sulfate | Fisher | M63-500 | Add to 1 mM final concentration. Prepare as a 1 M stock in water and autoclave. | |
| Glucose | Fisher | D16-3 | Add to 0.2% final concentration. Prepare as a 20% stock in water and autoclave. | |
| Casamino acids | Beckton-Dickinson | 223050 | Add to 0.5% final concentration. Prepare as a 20% stock in water and autoclave. | |
| Arginine | Sigma | A5131 | Add to 0.4% final concentration. Prepare as a 20% stock in water and filter sterilize. This alternative carbon/energy source can replace glucose and casamino acids | |
| Microtiter plates | Beckton-Dickinson | 353911 | Falcon 3911, Microtest III, Flexible assay plates, 96 well, U-bottom, non-sterile, non-tissue-culture treated. | |
| Microtiter plate lids | Beckton-Dickinson | 353913 | The lids can be reused by cleaning with 95% ethanol in water. | |
| Crystal violet | Sigma | 229641000 | Prepare as a 0.1% solution in water. |
Referências
- O’Toole, G. A., Kolter, R. Initiation of biofilm formation in Pseudomonas fluorescens WCS365 proceeds via multiple, convergent signalling pathways: a genetic analysis. Mol. Microbiol. 28, 449-461 (1998).
- O’Toole, G. A., Doyle, R. J. . Methods in Enzymology. , 91-109 (1999).
- Mah, T. F. A genetic basis for Pseudomonas aeruginosa biofilm antibiotic resistance. Nature. 426, 306-310 (2003).
- Kuchma, S. L., Connolly, J. P., O’Toole, G. A. A three-component regulatory system regulates biofilm maturation and type III secretion in Pseudomonas aeruginosa. J Bacteriol. 187, 1441-1454 (2005).
- Caiazza, N. C., O’Toole, G. A. SadB is required for the transition from reversible to irreversible attachment during biofilm formation by Pseudomonas aeruginosa PA14. J Bacteriol. 186, 4476-4485 (2004).
- Shanks, R. M., Sargent, J. L., Martinez, R. M., Graber, M. L., O’Toole, G. A. Catheter lock solutions influence staphylococcal biofilm formation on abiotic surfaces. Nephrol Dial Transplant. 21, 2247-2255 (2006).
- Caiazza, N. C., Merritt, J. H., Brothers, K. M., O’Toole, G. A. Inverse regulation of biofilm formation and swarming motility by Pseudomonas aeruginosa PA14. J. Bacteriol. 189, 3603-3612 (2007).
- Hinsa, S. M., Espinosa-Urgel, M., Ramos, J. L., O’Toole, G. A. Transition from reversible to irreversible attachment during biofilm formation by Pseudomonas fluorescens WCS365 requires an ABC transporter and a large secreted protein. Mol Microbiol. 49, 905-918 (2003).
- Mack, D. Characterization of transposon mutants of biofilm-producing Staphylococcus epidermidis impaired in the accumulative phase of biofilm production: genetic identification of a hexosamine-containing polysaccharide intracellular adhesin. Infect. Immun. 62, 3244-3253 (1994).
- Vidal, O. Isolation of an Escherichia coli K-12 mutant strain able to form biofilms on inert surfaces: involvement of a new ompR allele that increases curli expression. J. Bacteriol. 180, 2442-2449 (1998).
- Junker, L. M., Clardy, J. High-throughput screens for small-molecule inhibitors of Pseudomonas aeruginosa biofilm development. Antimicrob Agents Chemother. 51, 3582-3590 (2007).
