मानव प्रोटिओमिक विश्लेषण के लिए शीशे शारीरिक तत्वों के विच्छेदन

Summary

यह वीडियो फर्क और विदारक पोस्टमार्टम आँखों में मानव कांच का शरीर के विभिन्न अर्द्ध पारदर्शी संरचनाओं के लिए एक प्रभावी तकनीक से पता चलता है.

Abstract

कांच का एक ऑप्टिकली स्पष्ट, collagenous बाह्य मैट्रिक्स है कि आँख और रेटिना overlies के अंदर भरता है कांच substructures और रेटिना ^के बीच 1,2 असामान्य बातचीत आंसू और रेटिना टुकड़ी, धब्बेदार तह, धब्बेदार छेद सहित कई vitreoretinal रोगों, आबाद, उम्र से संबंधित धब्बेदार अध: पतन, vitreomacular कर्षण, proliferative vitreoretinopathy, proliferative मधुमेह रेटिनोपैथी, और विरासत में मिला vitreoretinopathies ^1,2. शीशे substructures की आणविक संरचना ज्ञात नहीं है. चूंकि कांच शरीर सीमित शल्य चिकित्सा का उपयोग के साथ पारदर्शी है, यह मुश्किल हो गया है अपने substructures को आणविक स्तर पर अध्ययन. हम एक अलग और प्रोटिओमिक और जैव रासायनिक विश्लेषण के लिए इन ऊतकों के संरक्षण की विधि विकसित की है. इस प्रयोगात्मक वीडियो में विच्छेदन तकनीक से पता चलता है कैसे कांच का आधार है, पूर्वकाल hyaloid, कांच कोर, और शवपरीक्षा मानव आँखों से शीशे प्रांतस्था को अलग करने के लिए. प्रत्येक कांच घटक के एक आयामी एसडीएस पृष्ठ विश्लेषण से पता चला है कि हमारे विच्छेदन तकनीक चार अद्वितीय प्रोटीन मानव कांच का शरीर के प्रत्येक बुनियाद इसी प्रोफाइल के परिणामस्वरूप. विभिन्न compartmentalized प्रोटीन की पहचान उम्मीदवार अणुओं विभिन्न vitreoretinal रोगों अंतर्निहित प्रकट होगा.

Protocol

1. पूर्वकाल खंड विच्छेदन. कॉर्निया पहले किनारी पर पूर्वकाल कक्ष का उपयोग एक 15 ° ब्लेड (चित्रा 1) में एक चीरा द्वारा हटा दिया जाता है. फिर घुमावदार कॉर्निया-scleral कैंची की एक ब्लेड पूर्वकाल कक्ष में डाला जाता है. परिधीय कटौती कॉर्निया में बना रहे हैं, बस किनारी के लिए पूर्वकाल. 0.12 Colibri संदंश और Westcott कैंची परितारिका circumferentially सिलिअरी शरीर के लिए पूर्वकाल में कटौती करने के लिए उपयोग किया जाता है. लेंस नाभिक 0.12 Colibri संदंश या एक 15 ° (supersharp) ब्लेड और प्रांतस्था और संदंश के साथ कैप्सूल के साथ हटा दिया जाता है. 2. शीशे कोर आकांक्षा. एक सिरिंज 5 – सीसी पर एक 23 गेज सुई में डाला जाता है मध्य – कांच (चित्रा 1). लगभग 1 या कांच कोर एमएल अधिक धीरे से aspirated है. नमूना तो एक microfuge ट्यूब में और फिर तरल नाइट्रोजन में रखा जाता है. 3. पूर्वकाल Hyaloid विच्छेदन. पूर्वकाल hyaloid अर्द्ध पारदर्शी एक अंगूठी के रूप में एक हंस गर्दन खुर्दबीन प्रकाश से घटना प्रकाश का समायोजन करके देखा जाता है. कांच कोर पिछले आकांक्षा आसान पहचान के लिए अन्य संरचनाओं से पूर्वकाल hyaloid अलग करती है. लोचदार ऊतक की चादर ध्यान Colibri या ड्रेसिंग संदंश के साथ सिलिअरी शरीर से दूर खींच लिया और Vannas कैंची से काट. यह पैंतरेबाज़ी दोहराया है. नमूना तो एक microfuge ट्यूब में और फिर तरल नाइट्रोजन में रखा जाता है. 4. शीशे बेस विच्छेदन. 0.12 संदंश का उपयोग करने के लिए आँख कप स्थिर, Westcott कैंची चार समान रूप से स्थान ऑप्टिक तंत्रिका सिर की दिशा में सिलिअरी शरीर से तनाव से राहत में कटौती करके "फूल" आँख करने के लिए उपयोग किया जाता है. सिलिअरी शरीर (चित्रा 2) के pars plicata Westcott कैंची का उपयोग quadrants में से प्रत्येक से निकाल दिया जाता है. कांच का आधार तो pars प्लाना और रेटिना (चित्रा 2) से अधिक संदंश के साथ ora serrata के दोनों तरफ समझा है. कांच के आधार पर निरंतर कर्षण संदंश के साथ लागू किया जाता है. Westcott कैंची के साथ अनुक्रमिक काटने एक "मोती की स्ट्रिंग" उपस्थिति के साथ एक अर्द्ध पारदर्शी ऊतकों के अर्क के रूप में यह excised है. नमूना तो एक microfuge ट्यूब में और फिर तरल नाइट्रोजन में रखा जाता है. 5. शीशे प्रांतस्था हटाना. pars प्लाना Westcott कैंची के साथ quadrants में से प्रत्येक से लगभग 3 मिमी पत्रक ora serrata (चित्रा 2) पीछे काटने से excised है. ऊतक पत्रक के बीच, कांच प्रांतस्था एक अर्द्ध पारदर्शी फिल्म के रूप में कल्पना की है. लोचदार फिल्म या तो 0.12 संदंश के साथ समझा जाता है या एक Weck Cel शल्य स्पंज पालन द्वारा आयोजित है. कांच प्रांतस्था तो रेटिना से दूर खींच लिया है और Westcott कैंची (चित्रा 1) के साथ excised. नमूना एक microfuge ट्यूब में और फिर तरल नाइट्रोजन में रखा गया है. सभी नमूनों -80 पर संग्रहीत डिग्री सेल्सियस जब तक प्रयोग के लिए उपयोग कर रहे हैं. 6. प्रतिनिधि परिणाम ऊतकों के नमूनों विशिष्ट प्रयोगों के लिए तरीकों की एक किस्म के द्वारा संसाधित किया जा सकता है. हमारे मामले में, नमूने विश्लेषण के लिए प्रोटीन एसडीएस PAGE (चित्रा 3) के द्वारा प्रस्तुत किया गया. चित्रा 1. मानव आँख के क्रॉस अनुभागीय दृश्य कांच का शरीर के विभिन्न substructures चित्रण सबसे पूर्वकाल कांच का एक पतली collagenous परत पूर्वकाल hyaloid बुलाया है. कांच कोर कांच शरीर के पूरे मध्य क्षेत्र शामिल हैं. शीशे के इस भाग को और अधिक कांच का आधार है, जो काफी चिपचिपा संदंश के द्वारा समझा जा और मजबूती से अंतर्निहित सिलिअरी शरीर और रेटिना से जुड़ी है के विपरीत में जलीय है. कांच कोर शामिल किया है एक बहुत पतली collagenous बुलाया शीशे प्रांतस्था खोल है. चित्रा 2. शीशे आधार शरीर रचना विज्ञान कांच आधार कांच ora serrata (सफेद तीर), जो विभाजित सिलिअरी शरीर और रेटिना अलग लाइन है के किनारे स्थित शरीर के एक अर्द्ध पारदर्शी आधार है. कांच का आधार पूर्वकाल सिलिअरी शरीर के pars प्लाना (सफेद रेखा) सीमा से अधिक फैली हुई है. कांच आधार के पीछे सीमा ora serrata (सफेद डेश) के पीछे 2 3 मिमी फैली हुई है. आबकारी कांच का आधार, संदंश ऊतक समझ और यह अंतर्निहित सिलिअरी शरीर और रेटिना से दूर खींच करने के लिए उपयोग किया जाता है. एक बार ऊपर उठाया, Westcott कैंची बेस के साथ कटौती करने के लिए उपयोग किया जाता है. चित्रा 3. पूर्वकाल hyaloid के लिए शीशे शारीरिक तत्वों के एसडीएस पृष्ठ एक आयामी. कुल प्रोटीन सांद्रता, कांच का आधार, vitreous कोर, और कांच प्रांतस्था 11.24, 20.1, 16.61, 14.24 मिलीग्राम / एमएल, क्रमशः थे. जेल वैद्युतकणसंचलन 45 मिनट के लिए 200 केवी पर प्रदर्शन किया था, फ्लेमिंगो (जैव रेड) के साथ दाग, और VersaDoc इमेजिंग प्रणाली (जैव रेड) का उपयोग करते हुए कल्पना. विभिन्न ऊतकों के लिए प्रोफाइल के कई समान बैंड दिखाने के लिए, या तो संरक्षित या प्रोटीन पार contaminating के रूप में के रूप में अच्छी तरह से अद्वितीय बैंड (तारांकन) का संकेत है, विभिन्न स्थानीयकृत प्रोटीन का संकेत है.

Discussion

कांच का आधार है, कोर, प्रांतस्था, और पूर्वकाल hyaloid: कांच शरीर अर्द्ध पारदर्शी एक जेल जिनकी आणविक संरचना खराब अपने substructures के स्तर पर विशेष रूप से समझा है. कांच कोर कोलेजन द्वितीय, वी, ग्यारहवीं, और XI होते हैं, chondroitin सल्फेट proteoglycans, हेपारन सल्फेट proteoglycans, और ^1,2 hyaluronan. शीशे कोर में प्रोटीन बायोमार्कर के साथ मधुमेह रेटिनोपैथी जैसे रोगों के साथ संबद्ध किया ^गया 3-5 . इन प्रोटीनों substructures के प्रत्येक में विभिन्न व्यक्त कर रहे हैं, और कई मामलों में विशिष्ट प्रोटीन की पहचान, नहीं जाना जाता है. ये विवरण अंतर्दृष्टि विशिष्ट vitreoretinal रोगों के साथ जुड़े प्रोटीन के मूल दे और लक्ष्य भविष्य उपचार में मदद मिल सकती है. हालांकि ऊतक विच्छेदन के लिए इष्टतम पोस्टमार्टम अंतराल निर्धारित नहीं किया गया है, प्रोटीन गिरावट बहाव के प्रयोगों को प्रभावित कर सकता है. उदाहरण के लिए, immunohistochemistry 12 घंटे शवपरीक्षा आँखों में प्रभावित है और कुछ विशेष एंजाइम गतिविधियों के कुछ ही घंटों के भीतर कम किया जा सकता है (अप्रकाशित अवलोकन). इस अध्ययन में सभी ऊतकों की मौत के 2 और 8 घंटे के बीच प्रोटीन अभिव्यक्ति या प्रोटिओमिक्स analsyis के लिए उपयुक्तता में महत्वपूर्ण बदलाव के बिना एकत्र किए गए थे. संरक्षण के तरल नाइट्रोजन ठंड विधि निर्धारण पर चुना जाता है लगानेवाला पार जोड़ने, जो LC-MS/MS द्वारा किया गया है अन्य ऊतकों में प्रदर्शन की वजह से प्रोटीन संरचना में छोटे परिवर्तन को रोकने के ^क्रम में 6 प्रोटिओमिक अध्ययन सही करने के लिए की क्षमता पर निर्भर करेगा कांच के विभिन्न डिब्बों के रूप में इस वीडियो प्रयोग में प्रदर्शन काटना. हम विच्छेदन तकनीक का उपयोग कर एक आयामी एसडीएस PAGE पुष्टि की है. जैसा कि हमारे परिणाम बताते हैं, वहाँ विभिन्न विभिन्न कांच का शरीर substructures में प्रोटीन व्यक्त कर रहे हैं. इन प्रोटीनों की पहचान कांच compartmentalization की एक अधिक विस्तृत समझ प्रदान करेगा.

Materials

Name	Company	Catalog Number
0.12 forceps	Storz Ophthalmics	E1502
5-cc syringe	Becton-Dickinson	309603
Straight Dressing Forceps With Serrations	Storz Ophthalmics	E1400
23 gauge needle	Becton-Dickinson	305145
Colibri forceps	Storz Ophthalmics	2/132
Castroviejo angled corneal scissors	Storz Ophthalmics	E3223
Vannas Curved Capsulotomy Scissors	Storz Ophthalmics	E3387
Weck-Cel surgical spears	Medtronic	0008680
Westcott Curved Tenotomy Scissors	Storz Ophthalmics	E3320