プロテオーム解析のための人間の硝子体の要素の解剖

Summary

このビデオでは、死後の目には人間の硝子体の様々な半透明の構造を差別化し、解剖のための効果的なテクニックを示しています。

Abstract

硝子体は眼球と覆って網膜の内側を満たす光学的に透明な、コラーゲン細胞外マトリックスである。硝子体下部構造と網膜の間に^1,2異常の相互作用は網膜裂傷や剥離、黄斑パッカ、黄斑円孔を含むいくつかの網膜硝子体疾患を、根底加齢黄斑変性症、vitreomacularのトラクション、増殖性硝子体網膜症、増殖性糖尿病網膜症、および継承された^{vitreoretinopathies。1,2}硝子部分構造の分子組成が知られていない。硝子体は、限定された外科的アクセスが透過的に行われるので、それは分子レベルでその下部構造を勉強することは困難であった。我々は、プロテオミクスと生化学的解析のために、これらの組織を分離して保存する方法を開発した。この実験的な映像で解剖手法は、死後、人間の眼から硝子体基部、前部硝子体、硝子体コア、および硝子体皮質を分離する方法を示しています。各ガラス成分の一次元SDS – PAGE分析では、私たちの解剖技術が人間の硝子体の各部分構造に対応する4つのユニークな蛋白質のプロファイルをもたらしたことを示した。差動区画化タンパク質の同定は、様々な網膜硝子体疾患の根底にある候補分子を明らかにする。

Protocol

1。前眼部の解剖。 角膜は、最初の15 °のブレード（図1）を用いて前房に角膜輪部で切開することによって除去される。その後、湾曲した角膜強膜はさみの一方のブレードは、前房に挿入されます。円周カットは、角膜輪部にちょうど前方、角膜に作られています。 0.12コリブリ鉗子とウェストコットの鋏は、毛様体の円周方向に前方アイリスを切り取るために使用されています。 レンズ核は0.12コリブリ鉗子または15 °刃（supersharp）とピンセットを用い、皮質およびカプセルで削除されます。 2。硝子体コア吸引。 5 ccシリンジで23ゲージの針が挿入されます半ば硝子体（図1）。 約硝子体コアを1 mL以上を静かに吸引される。 次に、試料を遠心管にし、液体窒素中に配置されます。 3。前部硝子体の解剖。 前部硝子体は、ガチョウの首の顕微鏡の光源からの入射光を調整することによって、半透明のリングとして見られている。硝子体コアの前の吸引は、簡単に識別するために他の構造体から前方の硝子体を分離する。 弾性組織のシートは慎重にコリブリまたは麦粒鉗子と毛様体から離れて引っ張られ、Vannasのはさみでカットされます。この操作が繰り返されます。 次に、試料を遠心管にし、液体窒素中に配置されます。 4。硝子体ベースの解剖。 アイカップを安定させるために0.12鉗子を使用して、ウェストコットのはさみは、視神経乳頭に向かって毛様体からの4つの等間隔のストレス解消になるの削減を行うことによって"花"の目に使用されます。 毛様体（図2）の同価のplicataはウェストコットのはさみを使用して、象限のそれぞれから削除されます。 硝子体のベースは、毛様扁平と網膜（図2）上の鉗子と鋸状縁のどちら側でも把握している。 硝子体ベース上で連続的な牽引力は鉗子で適用されます。ウェストコットのはさみを持つシーケンシャル切削は、それを摘出されている外観"真珠の数珠"と半透明の組織を抽出する。 次に、試料を遠心管にし、液体窒素中に配置されます。 5。硝子体皮質除去。 パルスプラナは鋸状縁（図2）の後、約3 mmのリーフレットをカットしてウェストコットのはさみと象限の各々から切り出される。 組織のリーフレットとの間で、硝子体皮質が、半透明フィルムとして可視化される。 弾性膜はどちら0.12鉗子で把持またはベックリキセル手術用スポンジへの遵守が保有しています。硝子体皮質は、その後離れて網膜から引っ張られ、ウェストコットハサミ（図1）で切り出しています。 サンプルは、マイクロ遠心チューブにして、液体窒素内に配置されます。実験のために利用されるまで、すべてのサンプルは-80℃で保存されています。 6。代表的な結果組織サンプルは、特定の実験のための様々な方法で処理することができます。私たちのケースでは、サンプルはSDS – PAGE（図3）によってタンパク質分析のために提出された。 図1。硝子体の別の部分構造を描いた人間の眼の断面図。最前硝子体は薄いコラーゲン層前部硝子体と呼ばれる。硝子体コアは、硝子体の全体の中央領域を含む。硝子体のこの部分には、鉗子で把持するのに十分な粘性であり、しっかりと基礎と毛様体と網膜に接続されているガラスベースとは対照的に、より多くの水です。硝子体コアを包含する硝子体皮質と呼ばれる非常に薄いコラーゲンのシェルです。 図2。硝子体の基本解剖学は。硝子体基部には毛様体や網膜を分離する境界線である鋸状縁（白矢印）、に沿って位置硝子体の半透明の部分構造である。硝子体基部の前縁には毛様体の毛様扁平（白い線）にわたって広がっている。硝子体基部の後縁は、ORAのコナラ（白ダッシュ）の後2〜3 mmを拡張します。消費税​​に硝子体基部には、鉗子は、組織を把握し、基盤となる毛様体および網膜からそれを引き離すために使用されます。一度上昇、ウェストコットはさみ、ベースに沿って切断するために使用されます。 図3。硝子体の要素の一次元SDS – PAGE。前部硝子体、硝子体ベース、VITの総タンパク質濃度reousコア、および硝子体皮質はそれぞれ11.24、20.1、16.61、14.24 mg / mLのであった。ゲル電気泳動は、45分間、200kVで行ったフラミンゴ（Bio – Rad社）で染色し、そしてVersaDocイメージングシステム（Bio – Rad）を用いて可視化した。異なる組織のプロファイルは、差動ローカライズされた蛋白質を示し、（アスタリスク）保存やタンパク質の相互汚染だけでなく、ユニークなバンドのいずれかを示す、いくつかの同様のバンドを示す。

Discussion

硝子体ベース、コア、皮質、および前部硝子体：硝子体は、その分子組成の悪い、特にその部分構造のレベルで、理解されている半透明のジェルです。硝子体コアは、糖尿病性網膜症などの疾患に関連付けられているコンドロイチン硫酸プロテオグリカン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、および硝子体コアのヒアルロン酸^。1,2タンパク質のバイオマーカーと一緒に、コラーゲンII、V、IX、およびXIが含まれています^。3-5方法これらのタンパク質は、差動部分構造のそれぞれで表され、そして多くの場合、特定のタンパク質の同一性は、知られていない。これらの詳細については、特定の網膜硝子体疾患に関連するタンパク質の起源への洞察を与え、ターゲットの将来の治療を助けるかもしれない。組織郭清のための最適な死後の間隔が決定されていないが、タンパク質分解は、下流の実験に影響を与える可能性があります。例えば、免疫組織化学は、12時間の死後の目といくつかの特定の酵素の活動に影響を受けています（未発表観察）、数時間以内に短縮することができます。本研究ではすべての組織は、タンパク質の発現やプロテオミクスのanalsyisへの適合性を大幅に変更することなく、死の2と8時間の間に採取された。保全の液体窒素凍結法は、LC-MS/MSによって他の組織で実証されているリンクを固定クロス、によって引き起こされる蛋白質の構造の小さな変化を防ぐために、固定優先して選択される⁶プロテオミクス研究は、正確に能力に依存しますとしてこのビデオの実験で示されて硝子体の異なる区画を、詳細に分析します。我々は1次元SDS – PAGEを用いて解剖手法を検証しています。我々の結果が示唆するように、差動、様々な硝子体のサブ構造体中のタンパク質をそこに表現されています。これらのタンパク質を同定することは硝子体のコンパートメントのより詳細な理解を提供します。

Materials

Name	Company	Catalog Number
0.12 forceps	Storz Ophthalmics	E1502
5-cc syringe	Becton-Dickinson	309603
Straight Dressing Forceps With Serrations	Storz Ophthalmics	E1400
23 gauge needle	Becton-Dickinson	305145
Colibri forceps	Storz Ophthalmics	2/132
Castroviejo angled corneal scissors	Storz Ophthalmics	E3223
Vannas Curved Capsulotomy Scissors	Storz Ophthalmics	E3387
Weck-Cel surgical spears	Medtronic	0008680
Westcott Curved Tenotomy Scissors	Storz Ophthalmics	E3320