Estabelecer embrionárias de rato Cultura de Células-tronco neurais utilizando o ensaio Neurosphere

Resumo

Este protocolo de vídeo demonstra a aplicação do ensaio neurosphere para o isolamento e expansão de células-tronco neurais do eminências ganglionares do dia 14 de embriões de rato-cérebro.

Resumo

Em mamíferos, as células-tronco atua como uma fonte de células indiferenciadas para manter gênese ea renovação celular em diferentes tecidos e órgãos, durante o tempo de vida do animal. Eles podem potencialmente substituir as células que são perdidas no processo de envelhecimento ou em processo de lesão e doença. A existência de células-tronco neurais (NSCs) foi primeiramente descrita por Reynolds e Weiss (1992) no adulto sistema central de mamíferos nervoso central (SNC), utilizando um novo sistema de cultura sem soro, o ensaio neurosphere (NSA). Com este ensaio, também é possível isolar e ampliar NSCs de diferentes regiões do SNC embrionárias. Estes, NSCs vitro expandidas são multipotentes e podem dar origem aos três principais tipos de células do SNC. Enquanto a NSA parece relativamente simples de executar, atenção para os procedimentos demonstrado aqui é necessário para alcançar resultados confiáveis ​​e consistentes. Este vídeo demonstra praticamente NSA para gerar e expandir NSCs partir do dia 14 de embriões de rato-tecido cerebral e fornece detalhes técnicos para que se possa atingir culturas neurosphere reprodutível. O procedimento inclui a colheita E14 embriões de camundongos, microdissecção cérebro para colher as eminências ganglionares, a dissociação do tecido colhido em meio NSC para ganhar uma suspensão de células individuais, e, finalmente, cultivo de células em cultura NSA. Depois de 5-7 dias em cultura, o que resulta neurospheres primários são várias passagens para expandir ainda mais o número do NSCs para futuros experimentos.

Protocolo

1. Configuração básica antes de prosseguir para dissecção:

1. Volume apropriado de meio NSC completo é preparado pela mistura NeuroCult NSC Basal Medium e Suplementos NeuroCult NSC Proliferação na proporção 9:1, respectivamente.
2. O meio é aquecido em banho-maria a 37 ° C.
3. Frio HEPES-buffered meio mínimo essencial (HEM), com alta concentração de antibióticos (10%) está preparado para dissecção e propósito de lavar roupa. Alternativamente, NSC meio basal com a suplementação de antibióticos também pode ser utilizado para esta finalidade.
4. 25-30 mL de HEM frio contendo antibióticos é dispensada em tubos de 50 ml estéril para a coleta d....

Discussão

O ensaio neurosphere é o método de escolha para o isolamento e expansão de células-tronco neurais ^05/01 devido à sua simplicidade e reprodutibilidade. Este ensaio é uma ferramenta inestimável para a geração em larga escala de células indiferenciadas células do SNC precursor, o que poderia ser usado para ambos in vitro e in vivo. Deve ser enfatizado que neurospheres poderiam ser gerados a partir de ambos os bona fide células-tronco neurais e progenitores mais restrito. Portanto, o cálculo da .......

Materiais

* Para fazer HEM, misture 110L pacote de MEM and160ml de HEPES 1M e obter um volume de 8,75 L com água destilada. Definir o pH final para 7,4 e armazená-lo a 4 ° C.