الكمي للdsDNA باستخدام F - 7000 هيتاشي الإسفار الطيف وصبغ PicoGreen

Summary

مظاهرة الكمي للdsDNA باستخدام المسابر الجزيئية PicoGreen صبغ وهيتاشي الطيف الإسفار F – 7000 مجهزة التبعي microplate القارئ.

Abstract

الكمي من الحمض النووي ، وخصوصا في تجمعات صغيرة ومهمة هامة مع مجموعة واسعة من التطبيقات بما في ذلك المعايير البيولوجية المقايسات البيولوجيا الجزيئية مثل تجميع وتنقية من الحمض النووي ، والتطبيقات التشخيصية مثل الكمي للمنتجات تضخيم الحمض النووي ، والكشف عن جزيئات الحمض النووي في قضايا المخدرات التحضيرات. خلال هذا الفيديو سوف نظهر قدرة الطيف هيتاشي F – 7000 الإسفار مجهزة التبعي بلايت القارئ الصغير لأداء dsDNA الكمي باستخدام المسابر الجزيئية كوانت ، أنه كاشف صبغ PicoGreen عدة.

في الطيف F – 7000 الإسفار عروض حساسية عالية وقياسات سرعة عالية. وهو نظام مرن للغاية قادرة على قياس مضان ، التألق ، وتفسفر. طرق قياس عدة متاحة ، بما في ذلك فحص الطول الموجي والمسح الضوئي الوقت ، وقياس الضوء وقياس 3 – D الفحص. معمل لديه حساسية في مجموعة من 50 من picomoles فلوريسئين عند استخدام حجم العينة 300 ميكرولتر في microplate ، وقادر على قياس سرعة فحص 60000 نانومتر / دقيقة. كما أن لديها مجموعة واسعة ديناميكية تصل إلى 5 أوامر من حجمها والذي يسمح لاستخدام منحنيات المعايرة على طائفة واسعة من التركيزات. نظام بصري يستخدم كل البصريات الانعكاسية للطاقة القصوى والحساسية. النطاق الموجي هو معيار 200-750 نانومتر ، ويمكن أن تمتد إلى 900 نانومتر عند استخدام واحدة من photomultipliers اختياري الأشعة تحت الحمراء القريب. ويسمح نظام التحكم في درجة الحرارة اختياري للقارئ لوحة 5-60 درجة مئوية درجة الحرارة باستخدام اختياري للرقابة الخارجية دائري السائل. القارئ microplate يسمح للاستخدام من 96 microplates جيدا ، وقياس سرعة لمدة 96 بئرا أقل من 60 ثانية عند استخدام النمط حركية.

ضوابط البرمجيات لF – 7000 ، وقارئ Microplate أيضا درجة عالية من المرونة. قد يتم تعيين العينات في عمود أو صف الأشكال سواء ، ويمكن اختيار أي مجموعة من الآبار للحصول على قياسات العينات. وهذا يسمح للاستخدام الأمثل للmicroplate. بالإضافة إلى ذلك ، يسمح برنامج استيراد التكوينات الدقيقة لوحة عينة التي تم إنشاؤها في Excel وحفظها في قيم مفصولة بفواصل ، أو "CSV" تنسيق. يمكن حفظ تكوينات Microplate قياس وأشار من قبل البرنامج للحصول على الراحة وزيادة الإنتاجية. يمكن أن يكون الناتج نتائج البيانات لتقرير القياسية ، إلى Excel ، أو إلى تقرير برنامج مولد اختيارية.

Protocol

1. إعداد صك بدوره على مقياس التألق الطيفي والسماح لالاحماء لمدة 1 ساعة. باستخدام Excel إنشاء ملف مع المعايير ونموذج البيانات ، كما هو مبين في الشكل (1) وحفظه في قيم مفصولة بفواصل "CSV" تنسيق. الشكل 1. المعايير وبيانات العينات. إعداد مقياس التألق على النحو التالي : انقر على زر ، وهذا فتح نافذة أسلوب التحليل ، كما هو موضح في الشكل رقم 2. الشكل 2. نافذة تحليل الأسلوب ، التبويب عام. بإجراء التحديدات التالية : في الميدان "القياس" ، حدد قياس الشدة الضوئية من سحب أسفل القائمة. في الحقل "المشغل" ، أدخل اسم المشغل المناسبة. ليست هناك حاجة لإدخال المعلومات في هذا المجال "الصك". يتم تحديد هذا تلقائيا بواسطة البرنامج. في "المعاينة" حقل غير نشط عند استخدام قارئ microplate. إدخال أية تعليقات التي قد تريد تضمينها في التقرير في هذا المجال "تعليقات". في الميدان "ملحقة" ، أدخل المعلومات المتعلقة الملحقات المستخدمة في هذا الاختبار. لاحظ الأزرار على الجانب الأيمن من النافذة. "تحميل" الزر يتيح تحميل أساليب التحليل التي تم حفظها سابقا. "حفظ" زر يسمح بتحديث مجموعة من المعلمات اختبار أو الطريقة التي تم حفظها سابقا التحليل وتحميلها ، وذلك باستخدام نفس الاسم. "حفظ باسم" الزر يتيح توفير مجموعة جديدة من المعلمات اختبار أو أسلوب التحليل تحت الاسم المطلوب. الآن انقر فوق علامة التبويب "الكميات" ، انظر الشكل رقم 3 وجعل التحديدات التالية. الشكل 3. نافذة تحليل الأسلوب ، التبويب الكميات. في الميدان "الكميات نوع" ، حدد الطول الموجي. يشير هذا وسوف تتاح القراءة مضان باستخدام الطول الموجي المحدد. في الميدان "معايرة نوع" ، حدد 1 ترتيب الحادي والعشرين. في الحقل "عدد من موجات" ، حدد 1. في الميدان "تركيز وحدة" ، أدخل نانوغرام / مل. إجازة غير محددة خانات "لمعايرة يدوي" و "القوة من خلال منحنى الصفر". في "الأرقام العشرية بعد نقطة" الحقل ، حدد 2. في الميدان "السفلى تركيز الحد" ، أدخل 0. في "أعالي تركيز مجال الحد ، أدخل 10000. الآن انقر على علامة التبويب "الصك" وجعل التحديدات التالية. الشكل 4. تحليل أسلوب النافذة ، التبويب الصك في "وضع البيانات :" حقل ، حدد الإسفار. "سرعة التقطيع" حقل غير نشط في هذا الوقت ، يتم استخدامه فقط لقياس تفسفر. في الميدان "الموجي النمط" ، حدد كلا WL الثابتة. في الميدان "EX / WL1" دخول 480nm. في "EM / WL1" حقل إدخال 520nm. كافة الحقول الأخرى بموجب EX وEM غير نشطة في هذا الوقت. في "شق EX" حقل حدد 5.0nm سحب من أسفل القائمة. في "شق EM" حقل حدد 5.0nm سحب من أسفل القائمة. إجازة غير محددة المربع أمام "الجهد PMT 1 – 1000V" الميدان. في "PMT الجهد" الحقل ، حدد 700V سحب من أسفل القائمة. في "كالك سيارات الإحصائية. رقم" حقل حدد 2. في مجال "يعيد" حدد 1. في الميدان "تكامل الوقت" حدد 0.1s </ لى> في الحقل "تأخير" أو تحديد دخول 0s. انقر فوق علامة التبويب "مراقب". الشكل 5. تحليل أسلوب النافذة ، التبويب مراقب. في "محور Y" ، "الحد الأقصى :" حقل ، حدد 10000 في "محور Y" ، "الحد الأدنى :" حقل ، حدد 0. حدد المربع الموجود على يسار "فتح تجهيز البيانات بعد الحصول على البيانات". إجازة غير محددة المربع الموجود على يسار "طباعة التقرير بعد الحصول على البيانات" ، إلا إذا كنت تريد التقرير المراد طباعتها تلقائيا بعد الانتهاء من القراءات. انقر فوق علامة التبويب "تقرير" ، انظر الشكل 6. الشكل 6. تحليل أسلوب النافذة ، تبويب التقرير. في الميدان "إخراج" ، حدد تقرير طباعة من القائمة المنسدلة. هل يمكن أيضا تحديد "استخدام تعليمات Microsoft Excel" إذا كنت تريد أن البيانات التي تم تصديرها إلى Excel ، أو "مولد طباعة ورقة استخدام" في حالة استخدام الوظيفة اختياري على مولد تقرير البرنامج الذي سيسمح توليد مخصص التقارير المقدمة. انقر فوق خانات للعناصر التي تريد إدراجها في التقرير. لحفظ جميع المعلمات في تحديد علامات تبويب مختلفة من النافذة "تحليل أسلوب" ، انقر مرة أخرى على علامة التبويب "عام" وحفظها تحت اسم ملف ومكان حيث يمكن العثور عليها لاستخدامها في المستقبل ، وانقر على " موافق "الزر لإغلاق هذه النافذة. هذا اكتمال إعداد المعلمات اختبار الصك. الآن سنقوم بإعداد microplate القارئ. انقر على زر ، والذي سيجلب إطار الإعداد MPR على القمة. حدد آبار للمواصفات والعينات في إطار التبويب MPR / اللوحة الإعداد ، كما هو مبين في الشكل 7. الشكل 7. MPR إطار الإعداد ، التبويب اللوحة. انقر على موقف A1 واسحب الماوس لE1 ، ثم انقر على الزر. وهذا اختيار المواقف التي ستستخدم لهذه المعايير. وسيتم تسليط الضوء تلك المواقف في اللون الأخضر. الآن نحن بحاجة لتحديد المواقف F1 لH3 للعينات. انقر واسحب الماوس بدءا F1 في الموقف ، لوضع H3 ثم انقر على زر ، وتسليط الضوء على هذا تلك المواقف في اللون الأصفر. ثم كرر العملية نفسها للمناصب لE3 A2 ، لتحديد تلك المواقف لقياسات العينات. الآن ، دعونا تحميل ملف الفاصلة المفصولة متغير (CSV) ملف معدة مسبقا مع المعايير والمعلومات نموذج. انقر على "حسنا المعلومات" التبويب "نافذة الإعداد MPR" ، كما هو مبين في الشكل 8. الشكل 8. MPR إطار الإعداد ، حسنا التبويب معلومات. ثم انقر على الزر. وهناك نافذة مفتوحة ويندوز اكسبلورر الذي كما هو مبين في الشكل 9 ، الأمر الذي سيتيح تحديد مكان وجود "حسنا information.csv" ملف وتحميله. الرقم 9. كذلك تحميل معلومات العينة. بعد تحميل "حسنا معلومات" الملف ، فإن "المعلومات حسنا" تبدو كما هو مبين في الشكل 10 الرقم 10. تحميل معلومات العينة جيدا. 2. Picogreen تحضير عينة الفحص إعداد 1X TE العازلة (10 ملي تريس ، حمض الهيدروكلوريك ، 1 ملم EDTA) وذلك بإضافة 1 مل من 20 العازلة TE Xإلى 19 مل دي H 2 O. تحضير محلول الكاشف PicoGreen بإضافة 50 ميكرولتر 200 الكاشف PicoGreen X ل9.95 مل 1 العازلة TE X. إعداد معايير (لامدا dsDNA) بجعل التخفيفات المتسلسلة لdsDNA الأسهم (100 ميكروغرام / مل). إعداد أول حل من 50 ميكروغرام / مل dsDNA بإضافة 25 ميكرولتر من dsDNA الأسهم (100 ميكروغرام / مل) و 25 ميكرولتر 1 العازلة TE س. ثم تعد الحلول القياسية من خلال إضافة وحدات التخزين من dsDNA وأشار العازلة كما هو موضح في الجدول أدناه : تركيز dsDNA حجم dsDNA حجم الاحتياطي 1 ميكروغرام / مل 20 ميكرولتر من 50 ميكروغرام / مل dsDNA 980 ميكرولتر 1 X TE العازلة 0،1 ميكروغرام / مل 100 ميكرولتر من 1 ميكروغرام / مل dsDNA 900 ميكرولتر 1 X TE العازلة 0.01 ميكروغرام / مل 100 ميكرولتر من 0،1 ميكروغرام / مل dsDNA 900 ميكرولتر 1 X TE العازلة 0،001 ميكروغرام / مل 100 ميكرولتر من 0.01 ميكروغرام / مل dsDNA 900 ميكرولتر 1 X TE العازلة 3. قياس المعايير والإسفار نموذج ماصة 150 ميكرولتر من كل معيار في آبار A1 – E1 من 96 لوحة جيدا ، في الشكل 7 ، وفقا للجدول التالي : جيد معيار A1 1 ميكروغرام / مل B1 0،1 ميكروغرام / مل C1 0.01 ميكروغرام / مل D1 0،001 ميكروغرام / مل E1 1 X TE العازلة ماصة 150 عينات غير معروفة في ميكرولتر F1 الآبار لH3 ، كما هو موضح في الشكل 7 من أجل حل PicoGreen أعدت في الخطوة 1.2 في حوض مصمم للاستخدام ماصة متعدد القنوات. استخدام ماصة متعدد القنوات لتقديم حل PicoGreen 150 ميكرولتر من الآبار A1 – H3. حل المزيج بلطف مع المعايير وماصة. لوحة في مكان مظلم ومنطقة الانتظار 2-5 دقائق للرد على تطوير. 4. ممثل النتائج يتم تقييم منحنى المعايرة جيدة باستخدام معلمات مختلفة يقدمها البرنامج F – 7000 على قياس المعايير وحساب منحنى المعايرة بواسطة البرنامج. معامل تقرير يشير الى الخير من يصلح لمعايير قياس والمعايرة منحنى المحسوبة. وهذه القيمة هي أقرب إلى "1" ، وأفضل تناسب قيمة قياس والمعايرة منحنى. إذا كانت القيمة هي أبعد ما تكون عن "1" ، لا بد من اعادة قياس المعايير ، التي أعدت مرة أخرى ، أو تغيير اللياقة البدنية للمنحنى المعايرة. ويبين الشكل 11 مثال على منحنى المعايرة مع احتساب معامل عزم = 0.99993 ، وحصل على تقدير من dsDNA باستخدام PicoGreen صباغة. الرقم 11. مثال على منحنى المعايرة dsDNA.

Discussion

pipetting الحذر أثناء إعداد العينات ، وكذلك باستخدام معمل مستقرة وحساسة مضان ضروري للحصول على نتائج جيدة وقابلة للتكرار.

في قضية معمل مضان يستخدم لهذا الاختبار ، يقترح استخدام 300 ميكرولتر حجم العينة النهائية في القارئ microplate. انخفاض حجم يقلل من الحساسية ، وزيادة حجمها قد يسبب التلوث المتبادل بين الآبار.

Materials

Material Name	Tipo	Company	Catalogue Number	Comment
Distilled H2O	Reagent
Quant-iT Picogreen dsDNA Assay Kit from Invitrogen	Reagent		P7589
Nalge Nunc Fluorescence Microplates p/n 237108	Supply		237108
12 Channel Eppendorf Micropipette	Supply		3516677
1000 μL Eppendorf Pipette	Supply
200 μL Eppendorf Pipette	Supply
10 mL serological pipet	Supply
Aluminum foil	Supply
Pipette tips	Supply
Hitachi F-7000 Fluorescence Spectrophotometer with FL Solutions 2.1	Equipment		5J1-0003
Microplate Reader Accessory for F-7000	Equipment		5J0-0139