우리는 RNAi를 사용하여 세포의 내생 BRCA1 단백질을 파괴하고 코딩 변경을 포함하는 BRCA1 포인트 돌연변로 대체하여 DNA 손상의 동종 재조합의 수리를 위해 조직 문화를 기반으로 분석에서 BRCA1 변종을 테스트하기위한 방법을 제공합니다.
missense 변이의 기능 분석은 내생 단백질의 세포에 존재에 의해 복잡하실 수 있습니다. BRCA1의 구조 기능 분석은 전체 길이 BRCA1 단백질과 hypomorphic BRCA1 단백질 1,2,3,4,5을 표현하는 세포 라인 작업 고유의 문제에 대한 강력한 분석의 부족에 의해 복잡하고 있습니다. 우리는 세포의 내생 BRCA1 단백질이 심하게 BRCA1의 mRNA의 3' – UTR을 대상으로 RNAi에 의해 고갈 및 BRCA1의 변형을 표현하는 플라스미드를 공동 transfecting으로 대체되었습니다 약자 시스템을 개발했습니다. 이 절차의 장점 중 하나는 BRCA1과 동시 교체의 급성 입을은 세포가 보조 돌연변이 BRCA1 또는 기능의 손실을 보상하기 위해 시간이 지남에 따라 발생할 수 adaptations없이 성장할 수 있도록한다는 것입니다. 이 고갈 및 추가 기능 다시 절차는 즉시 동종 재조합의 활동에 assayed되었습니다 헬라 유도 세포 라인에서 이루어졌다. 상동 재조합 분석은 재조합 기판은 게놈 (그림 1) 6,7,8,9에 통합되어 의하여 이전에 게시된 방법에 따라 달라집니다. 이 재조합 기판은 비활성 GFP allele의 내부 드문 절감 I – SceI 제한 효소 사이트를 가지고 있으며, 하류 두 번째 비활성 GFP의 allele입니다. 상동 재조합에 의해 수리 수있는 두 번 좌초 휴식에 I – SceI 결과를 표현하고, 상동 재조합은 휴식을 수리 않은 경우는 즉시 GFP 단백질의 표현 유동세포계측법에 의해 채점되어 활성 GFP의 allele를 생성하는 플라스미드의 Transfection . 내생 BRCA1의 고갈은 상동 재조합 활동에 8 – 10 – 배 감소하고, 추가 기능 다시 야생 형 플라스미드 완전 상동 재조합 복원 기능의. 전체 길이 BRCA1의 특정 지점 돌연변이 공동 transfected plasmids에서 표현되었을 때, 특정 missense의 돌연변이의 효과가 득점 수 있습니다. 예를 들어, BRCA1 (M18T) 단백질, 알 수없는 임상 중요성 10 변종의 표현이 이러한 세포로 표현되었다, 그것은 BRCA1 종속 상동 재조합을 복원하지 못했습니다. 또한 알 수없는 의미의 또 다른 변종의 명암, 표현에 의해, BRCA1은 (I21V) 완전 BRCA1에 의존 상동 재조합 기능을 복원. BRCA1 missense 변이의 기능을 테스트의이 전략은 centrosome 기능 (Kais 외, 관찰되지 않은)에 시금 다른 생물 학적 시스템에 적용되었습니다. 전반적으로, 이러한 방식은 recessively 분석해야하는 유전자의 missense의 돌연변이의 분석에 적합합니다.
이 방법의 장점은 우리가 야생 형 endogenously 표현 BRCA1을 가지고 세포를 사용 상동 재조합에 의해 DNA의 복구를 규제에서 BRCA1 단백질의 기능 연구를 수있다는 것입니다. 우리는 상동 재조합 과정을 공부하고 DNA 수리의 기능을 위해 BRCA1 변종 테스트를위한 소설 방법을 얻기 위해 RNAi – 중재 고갈을 이용한 두 가지 별도의 설립 방식을 채택했습니다. 이 방법의 성공을위한 열쇠는 우리가 GFP 변환의 매우 높은 수준을 얻는 것과 같은 게놈의 재조합 기판과 같은 헬라로 쉽게 transfectable 세포주를 확립하는 것이었다. 우리는 전혀 감지 배경 GFP 신호도 없었을 얻기 위해서는 원래의 변화의 여러 클론을 상영지만, 플라스미드 I – SceI 표현의 transfection에 따라 GFP 변환의 매우 높은 수준을했다했다.
이 방법을 통해, 우리는 이제 동종 재조합의 기능에 대한 다른 구체적인 BRCA1 아미노산 잔류물을 조사하고 있습니다. 이 작품의 생물 학적 통찰력과 함께, 이러한 결론은 임상 암 유전자에 적용할 수 있습니다. 많은 희귀한 변종이 있기 때문에 BRCA1 missense 변이의 높은 비율을 알 수없는 임상 중요성을 가지고 유전자 분리 분석 3,10,13,14하여 암 협회를 결정하기 위해 이들 중 많은 부족한 정보가있다. 이 방법을 사용하여 상동 재조합을 조절에서 BRCA1의 생물 학적 기능의 특정 변형의 결과는 자신의 게놈에서 이러한 변종 중 하나를 수행 여자를 알려하는 데 사용할 수 있습니다.
The authors have nothing to disclose.
우리는이 작품에 대한 자금 제공을위한 오하이오 주립 대학 종합 암 센터에 감사하고 있습니다.
Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
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DMEM | Invitrogen | 11960 | ||
FBS | USA Scientific | 9871-5200 | ||
siRNA | Invitrogen | N/A | ||
Lipofectamine-2000 | Invitrogen | 11668 | ||
TrypLE | Invitrogen | 12604 | ||
Puromycin | Enzo Life Sciences | BML-GR312 | ||
Opti-MEM I | Invitrogen | 31985 | ||
Sodium Pyruvate | Invitrogen | 11360 | ||
GlutaMAX I | Invitrogen | 35050 | ||
Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140 |