我々は、RNAiを用いて細胞から内因性のBRCA1蛋白質を破壊し、コーディングの変更が含まれているBRCA1点変異体でそれを置き換えることにより、DNA損傷の相同組換え修復のためのアッセイに基づいて組織培養でのBRCA1の変異体をテストするための方法を提供する。
ミスセンス変異の機能解析は、内因性蛋白質の細胞内の存在によって複雑になることがあります。 BRCA1の構造機能解析は、完全長のBRCA1タンパク質とhypomorphic BRCA1タンパク質1,2,3,4,5を発現する細胞系での作業における固有の困難のための堅牢な分析の欠如によって複雑にされています。我々は、細胞内の内因性のBRCA1タンパク質が急性BRCA1 mRNAの3' – UTRを標的RNAiにより枯渇し、BRCA1の変異型を発現するプラスミドをコトランスフェクトすることにより置き換えられてそれによってシステムを開発した。この手順の利点の一つは、BRCA1と同時交換の急性サイレンシングは、細胞がBRCA1の機能の損失を補償するために、時間の経過とともに発生する可能性のある二次変異または翻案することなく拡張できるようにすることです。この枯渇とアドインバックプロシージャは、容易に相同組換え活性を測定したHeLa細胞由来の細胞株で行われていた。相同組換えアッセイは、組換えの基質がゲノム(図1)6,7,8,9に統合されそれによって以前に発表された方法に基づいています。この組換えの基板は、非アクティブなGFPの対立遺伝子内部に珍しいカットI – SCEIの制限酵素部位を有し、そして下流の第二非アクティブなGFPの対立遺伝子である。相同組換えによって修復されることがあります二本鎖の休憩、のI – SCEI結果を表現し、相同組換えは、ブレークを修復しない場合は、容易にGFPタンパク質の発現のフローサイトメトリーにより採点され、アクティブなGFPの対立遺伝子を作成し、そのプラスミドのトランスフェクション。内因性のBRCA1の枯渇は、相同組換えの活性の8〜10倍減少をもたらし、そして野生型プラスミドを完全に復元された相同組換え機能のバック追加。完全長のBRCA1の特定の点変異体を共トランスフェクトしたプラスミドから発現させた場合、特定のミスセンス変異の効果は、得点することができます。例として、BRCA1(M18T)タンパク質、未知の臨床的意義10の変異体の発現は、これらの細胞で発現され、それはBRCA1依存相同組換えを復元に失敗しました。また意義が不明な別の変異体のそれとは対照的に、表現、、BRCA1(I21Vが)完全に復元されたBRCA1依存相同組換えの機能。 BRCA1のミスセンス変異の機能をテストするのこの戦略は、中心体機能(KAISら、未発表の観察)をアッセイする別の生物学的システムに適用されている。全体的に、このアプローチは、劣性分析する必要があります任意の遺伝子のミスセンス変異体の解析に適しています。
この方法の利点は、我々は、野生型内因的に発現BRCA1を持つ細胞を用いた相同組換えによるDNA修復を調節する上でBRCA1蛋白質の機能を勉強できるということです。我々は、相同組換えの過程を研究するのとDNA修復の機能のためにBRCA1の変異体をテストするための新規な方法を得るために、RNAiによる枯渇を利用する2つの別々の確立された方法を採用している。この方法の成功の鍵は、我々はGFPの変換の非常に高いレベルを得るようなゲノムの組換えの基質と、そのようなHeLa細胞のような容易にtransfectable細胞株を、確立することだった。我々は、検出可能なバックグラウンドのGFPシグナルを持っていたものを得るために元の変換の複数のクローンをスクリーニングしたが、プラスミドI – SCEIの発現のトランスフェクションによりGFPの変換の非常に高いレベルを持っていた。
この方法では、我々は今相同組換えにおける機能のための他の特定のBRCA1のアミノ酸残基を調査している。この作品からの生物学的洞察と一緒に、これらの結論は、臨床癌の遺伝学に適用することができます。多くの珍しい亜種が存在するので、BRCA1のミスセンス変異の割合が高い未知の臨床的意義を持っており、遺伝的分離分析3,10,13,14によって癌の関連付けを決定するために、これらの多くのための十分な情報があります。この方法を使用して、相同組換えの制御におけるBRCA1の生物学的機能上の特定の変異の影響は、それらのゲノム中にこれらの亜種を運ぶ女性たちに知らせるために使用することができる。
The authors have nothing to disclose.
我々はこの仕事のための資金を提供するためのオハイオ州立大学総合がんセンターに感謝しています。
Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
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DMEM | Invitrogen | 11960 | ||
FBS | USA Scientific | 9871-5200 | ||
siRNA | Invitrogen | N/A | ||
Lipofectamine-2000 | Invitrogen | 11668 | ||
TrypLE | Invitrogen | 12604 | ||
Puromycin | Enzo Life Sciences | BML-GR312 | ||
Opti-MEM I | Invitrogen | 31985 | ||
Sodium Pyruvate | Invitrogen | 11360 | ||
GlutaMAX I | Invitrogen | 35050 | ||
Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140 |