RNA התערבות קרציות

Summary

השיטה של ​​התערבות RNA (RNAi) בזריקה של dsRNA לתוך קרציות יאכילו מתואר. RNAi היא הנפוצה ביותר גנים והשתקת טכניקה קרציות שם שימוש בשיטות אחרות של מניפולציה גנטית הוגבל.

Abstract

קרציות הן ectoparasites hematophagous מחייבת של חיות ובני אדם בר מקומיים, נחשבים ברחבי העולם השנייה יתושים כמו וקטורים של מחלות אנושיות ¹ ואת הווקטורים החשובים ביותר המשפיעים על תעשיית הבקר העולמית ^2. קרציות מסווגים תת Acari, Parasitiformes סדר, suborder Ixodida ו מופצים ברחבי העולם מן הקוטב הצפוני אל באזורים טרופיים ^3. למרות המאמצים לשלוט מכת קרציות, ectoparasites אלה נשארים בעיה חמורה לבריאות בני אדם ובעלי חיים ^4,5.

התערבות RNA (RNAi) ⁶ היא גישה המבוססת על גרעין חומצה הפוך גנטי כרוך שיבוש של ביטוי גנים על מנת לקבוע תפקוד הגן או את השפעתו על מסלול מטבולי. RNAs התערבות קטנה (siRNAs) הם מולקולות של מפעיל מסלול RNAi כי הוא שיזם פעמיים תקועים RNA (dsRNA) ותוצאות השפלה עוצמה רצף ספציפי של mRNAs cytoplasmic המכיל את רצף זהה ההדק dsRNA ^7-9. פוסט תעתיק להשתקת גנים מנגנוני ביוזמת dsRNA התגלו אאוקריוטים כל למד עד כה, RNAi פותחה במהירות ככלי ללימודי גנומיקה תפקודית יישומים אחרים ¹⁰ במגוון רחב של אורגניזמים.

RNAi הפך הנפוצה ביותר גנים והשתקת טכניקה קרציות ואורגניזמים אחרים בו גישות חלופיות עבור מניפולציה גנטית אינם זמינים או ^5,11 אמין. אפיון גנטי של קרציות הוגבל עד הבקשה האחרונה של RNAi ^12,13. בזמן הקצר הזה RNAi כבר זמין, הוא הוכיח את עצמו להיות כלי רב ערך ללימוד פונקציה סמן גנטי, אפיון של ממשק קרציות הפתוגן והקרנת ואפיון של אנטיגנים סמן מגן ^14. בזאת, שיטה עבור RNAi באמצעות הזרקה של dsRNA לתוך קרציות יאכילו מתואר. סביר להניח כי הידע שנרכש גישה זו הניסוי יתרום משמעותית להבנה של מערכות ביולוגיות בסיסיות ופיתוח של חיסונים כדי לשלוט מכת סמן ולמנוע העברת סמן נישאים פתוגנים ^15-19.

Protocol

1. דור dsRNA. לסנתז פריימרים oligonucleotide המכיל רצפים T7 האמרגן עבור ב שעתוק במבחנה סינתזה של dsRNA (לדוגמה, עבור Dermacentor variabilis subolesin להשתמש primers oligonucleotide D8AAT75: 5'-TAATACGACTCACTATAGGGTACTGACTGGGATCCCCTGCACAGT-3 'ו D8DVT73: 5'-TAATACGACTCACTATAGGGTACTCGAGCTTGGTGGAAAGGACG-3 "). Amplify גן היעד על ידי RT-PCR באמצעות 10 pmol של פריימר כל oligonucleotide ו 1-10 ננוגרם של רנ"א סך לתקתק. לטהר את מוצר ה-PCR. לסנתז dsRNA באמצעות 8 μL של המוצר מטוהרים PCR. לכמת dsRNA ידי ספקטרומטריית. 2. הזרקה של קרציות עם dsRNA. 2.1. הכנת קרציות להזרקה. ראשית, לשטוף את קרציות בסדרה של פתרונות על ידי רועדת להם פתרון כל שפופרת 50 מ"ל צנטריפוגה חד פעמיות, decanting הפתרון באמצעות מסך חוט דק רשת מעל הצינור כדי לשמור על קרציות. רצף של פתרונות קרציות הכביסה מי ברז, מי חמצן 3%, שני שוטפת של מים מזוקקים, אתנול 70% ושני שוטף יותר עם מים מזוקקים. כתם יבש קרציות על מגבות נייר. הרוזן קרציות לקבוצות של 20 עד 50, תלוי בניסוי, המקום קרציות מקבוצה כל כוס פלסטיק 1.25 גרם עם מכסה מתאים בחוזקה תווית עם מספר קבוצת הניסוי. 2.2. סמן צוות ההזרקה. צוות RNAi מורכבת משלושה אנשים: (1) אדם אחד עמדות כל סמן על סרט דביק כפול מודבקת פיסת שעווה שיניים אדום, (2) אדם אחד מזריק את קרציות ו (3) אדם אחד המסכים קרציות לאחר זריקה, נושם CO 2 על קרציות כדי להפעיל אותם וסופר את קרציות החיים לתוך כוסות תווית עם מספר קבוצת הניסוי. כל חברי הצוות חייבים ללבוש כפפות חד פעמיות. 2.3. המיקום של קרציות להזרקה. לכידת סמן באמצעות מלקחיים דומון בסדר למקם אותו בצד הגחון על סרט דביק כפול מודבקת גיליון 3 "x 6" של שעווה שיניים אדום. קרציות ממוקמים יחדיו בקבוצות של 5 קרציות. מניחים רצועה קטנה של דבק על גפי כל 5 קרציות כדי לקדם לרסן אותם, אך תוך השארת רוב הגוף חשוף כל כך את תהליך ההזרקה ניתן לצפות על ידי סמן ההזרקה (איור 1). 2.4. הזרקה של קרציות. קרציות יהיה להזריק ברבע הימני התחתון של משטח הגחון של שלד חיצוני. ראשית, לנקב חור שלד באמצעות מזרק אינסולין Monoject מצויד ½ ", 29 מחט מד (איור 2 א). הזרק קרציות מיד עם μL 0.2-0.5 פתרון dsRNA (5 x אוקטובר 10-05 x 10 11 מולקולות לכל μL) באמצעות מזרק מחוייט עם המילטון 1 אינץ, 33 מחט מד עם נקודה 45 ° משופעים (איור 2b) . המחט צריך להיות ממוקם היטב לתוך חלל סמן כדי להבטיח את המיקום ושמירה של dsRNA. נוזל חלק עשוי להימלט מן הזריקה (איור 2 ג). יש להקפיד לא על להזריק את קרציות, אשר יגרום לאובדן hemolymph ועלולה לגרום למותם של סמן את. נקה את המזרק המילטון לאחר סיום זריקות בכל קבוצה ניסיונית. לפני השימוש עבור קבוצה אחרת ניסיונית. מלאו את המזרק הראשון כוס המכילה מי חמצן 3% ולאחר מכן לגרש לתוך מיכל פסולת, וחזור 15 פעמים. מלאו את המזרק מתוך כוס המכילה מים סטריליים ואז לגרש לתוך מיכל פסולת, וחזור 15 פעמים. הקפד לא לכופף את הבוכנה של המזרק המילטון, כי אם כפופות, הבוכנה לא יעברו בצורה חלקה להגיב למגע עדין נדרש הזרקה של קרציות. 2.5. טיפול קרציות לאחר ההזרקה. תרימי את סמן מוזרק מיד מהקלטת דביק כפול עם מלקחיים בסדר להניח אותו במיכל פלסטיק התאוששות (כ 6 "x 6" ועטור דבק כדי למנוע בריחה של קרציות). קרציות יהיה פעיל לזמן קצר לאחר ההזרקה, אבל צריך בקרוב להתחיל לזחול סביב המנה. נשימת CO 2 על קרציות מיד לאחר הצבתם במכולה התאוששות כדי לסייע להפעיל את קרציות. לאחר קרציות הן זחילה פעיל, הפצע יתרפא זריקה במהירות והם סביר להניח לשרוד. הרוזן קרציות לפי מספר בכל קבוצה ניסיוניים ולמקם אותם בכוס פלסטיק עם מכסה שכותרתו צפופות. קרציות החלפת צריך להיות מוזרק להחליף כל שכל נפטר לפני הזרקת קבוצת הניסוי הבא. 2.6. סמן מחזיק. מניחים את קרציות בתא לחות (12hr אור: 12 שעות photoperiod כהה 22-25 ° C ו 95% h יחסיתumidity) והחזק ליום 1. קרציות מקום קרציות האכלה תאים, אחד לכל קבוצת הניסוי, דבוק כבשה ולאפשר להם להאכיל עם מספר שווה של קרציות זכר או נקבה uninjected (לפי המין לא היה מוזרק). קרציות נקבה כי להאכיל את גודש, אלה יוסרו מן הכבשים לאחר 10 ימים של האכלה או כאשר הנקבות לשלוט כבר הוריד את המארחת נאספים שקל. מניחים את קרציות בקרטונים, והחזק בתא לחות עד השלמת ההטלה. הערכת ההטלה על ידי שקלול המוני ביצים המיוצר על ידי כל קרציות בקבוצה. 2.7. ניתוח של פנוטיפ סמן לאחר RNAi. הערכת סמן פנוטיפ לאחר האכלה על ידי קביעת מספר קרציות ששרדו, משקל סמן, ההטלה והפוריות ביצה. עם זאת, ניתוחים אחרים עשויים להתבצע בהתאם הגן לבין מטרות ממוקדות של המחקר. 3. ניתוח לאשר השתקת הגן על ידי RT-PCR. לנתח בלוטות הרוק ואת האומץ של קרציות בודדים מקבוצות שליטה הזריק ו-dsRNA מוזרק לאחר ההנקה. תמצית RNA הכולל דגימות רקמה בודדים. ניתוח תעתיקי גנים ברקמות יעד שונות על ידי זמן אמת RT-PCR ו לנרמל את רמות RNA נגד 16S rRNA סמן בשיטת genNorm (שיטת ddCT כמו מיושם על ידי Bio-Rad iQ5 Standard Edition, גרסה 2.0). הפעל עקומות דיסוציאציה בסוף התגובה על מנת להבטיח כי רק אחד amplicon נוצר וכי לפגל amplicons עקבי בטווח הטמפרטורה זהה עבור כל מדגם. השווה את רמות ה-mRNA (מנורמל לערכי CT) בין שליטה הזריק ו-dsRNA מוזרק באמצעות קרציות הסטודנטים `s t-test (p = 0.05). 4. נציג תוצאות: פרוטוקול המתואר במסמך נעשה שימוש במעבדה שלנו RNAi ב שונה מינים רבים סמן ixodid (טבלה 1). כמות dsRNA מוזרק קרציות משתנה עם גודלו של סמן את; מינים סמן גדול יכול להכיל נפח גדול יותר. קרציות שליטה שלילי צריך להיות מוזרק עם dsRNA שאינו קשור. DsRNAs מספר כגון subolesin 14-19,22-25,27-32,34 ו בטא אקטין 20,21 יכול לשמש שולטת חיובית. שים לב, חשוב לשטוף את המזרק בין הטיפולים, כדי למנוע ערבוב פתרונות dsRNA. אם הפרוטוקול הוא נעשה בצורה נכונה, פחות מ 5% תמותה יש לקבל זריקה ההליך לאחר 24 שעות. פנוטיפ אופייני אחרי מציאה גן קרציות מוצג באיור 3 עם פאנל של קרציות מוזרק עם בריכות של dsRNA כדי המסך סמן אנטיגנים מגן. סמן מינים dsRNA מוזרק הפניות קרצית scapularis ספריית cDNA, subolesin, אקטין, nucleotidase, NF-kB, akirin 21, 22, 29, 30 Dermacentor variabilis subolesin, GST, היוביקוויטין, vATPase, selenoproteins M ו W2a, hematopoietic גזע / ובתאים דמוי חלבון, למקטע אקטין פרוטאזום 26S, ferritin1, varisin, akirin 15, 19, 22, 24, 26, 30-32 Dermacentor marginatus subolesin 22 Amblyomma americanum ספריית cDNA, subolesin, akirin 17, 22, 30 Amblyomma hebraeum subolesin, voraxin 28 Rhipicephalus sanguineus Rs86, subolesin 22, 23 Rhipicephalus microplus GST, היוביקוויטין, selenoprotein, Bm86, Bm91, subolesin, העיכול, GIII, EF1a, חלבון flagelliform משי, von Willebrand גורם 16, 18, 25, 27 Rhipicephalus annulatus היוביקוויטין, subolesin, EF1a, GIII 16 טבלה 1. טיק מינים שבהם פרוטוקול RNAi כבר בשימוש. באיור 1. המיקום של קרציות, בצד הגחוני מעלה, בקלטת דביק כפול דבק גיליון של שעווה שיניים אדום. קרציות מוצבים בקבוצות של 5, לאחר מכן רצועה קטנה של דבק מונח על גפי על מנת להבטיח את המשך קרציות תוך מתן מזרק כדי לשמור על הגוף במהלך סמן את הזריקה. איור 2. ההליך כולל הזרקה (א) פירסינג ברבע הימני התחתון של שלד חיצוני לתקתק עם אינסולין סאיringe מצויד במחט 29 מד כדי ליצור אתר הזרקה, (ב) הזרמה מיידית של dsRNA באתר זה בעזרת מזרק עם מחט המילטון 33 מד אשר (ג) קרוב לוודאי תגרום לדליפת חלק hemolymph סמן / נוזלים. איור 3. פאנל של שש קבוצות סמן שבו RNAi שימש המסך אנטיגנים סמן המגן Amblyomma americanum. השינויים פנוטיפי ב קרציות ניתן לראות בהשוואה חיובי subolesin RNAi מלאה שליטה שלילי dsRNA קשור. בניסוי זה ההשפעה של RNAi על התמותה סמן, משקולות, ו ההטלה של כל קבוצה נותח סטטיסטית.

Discussion

למרות שיטות אחרות תוארו עבור RNAi ב ^{14 קרציות, 33,} הזרקה של dsRNA המתואר כאן הוא הנפוץ ביותר הן יאכילו (טבלה 1) והאכילה קרציות ^16,25,34. RNAi הוכח להיות כלי רב ערך לחקר תפקוד הגן סמן על האפיון של ממשק קרציות הפתוגן והקרנת ואפיון של אנטיגנים סמן מגן ^14,35. בפרט, RNAi הפך כלי חשוב ביותר עבור ניתוחים תפקודית קרציות ^35.

מתודולוגית, RNAi צפוי להתפתח שיטות יעילות יותר עשוי לאפשר מציאה גן במספר רב של אנשים. המנגנון של dsRNA-Induced RNAi ב קרציות צריך להיות מעודן לתרום להבנה טובה יותר וניצול של גישה זו הגנטי מין זה ^35,36. היקף מחוץ היעד ההשפעות של RNAi ב קרציות היא גם שאלה חשובה, כי יש לטפל באופן מלא ^14,27. לבסוף, RNAi סביר להניח לספק תרומות מקיף ללימוד תקנה סמן גנטי וביולוגיה מערכות קרציות הפתוגן ממשק עלולה להיות השפעה על התפתחות של חיסונים כדי לשלוט מכת סמן והעברת סמן נישאים פתוגנים.

Materials

Material Name	Tipo	Company	Catalogue Number	Comment
Access RT-PCR system		Promega	A1250
Purelink PCR purification kit		Invitrogen	K3100-02
Megascript RNAi kit		Ambion	AM1626M
Red dental wax		Electron Microscopy Sciences	72674
Plastic cups, 1.25 oz and lids		Solo Cup Company, Urbana Ill.
Fine forceps		Electron Microscopy Sciences	Various
Insulin syringe		Monoject		Fitted with a ½”, 29 gauge needle
Hamilton syringe		Hamilton	701SN,33/.375”/45DGR	Custom made
TriReagent		Sigma	93289
iScript One-Step RT-PCR Kit with SYBR Green		Bio-Rad	170-8892
Real-time PCR detection system		Bio-Rad	Several	Please refer to http://www.bio-rad.com/