Todo Recordings celular do cérebro de adultos Drosophila

Summary

Este vídeo demonstra o procedimento para isolar toda cérebros de adultos Drosophila em preparação para gravar a partir de neurônios individuais usando a tecnologia de célula padrão todo. Inclui imagens de células GFP rotulados e neurônios visto durante a gravação.

Abstract

Neste vídeo, demonstramos o procedimento para isolar toda cérebros de adultos Drosophila em preparação para gravar a partir de neurônios individuais. Começamos por descrever a solução de dissecação e captura das fêmeas adultas usadas em nossos estudos. O procedimento para a remoção de todo o cérebro intacto, incluindo ambos os lobos óptica, é ilustrado. Dissecção da traquéia sobrejacente também é mostrada. O cérebro isolado não é apenas pequena, mas necessita de cuidados especiais no manuseio, nesta fase, para evitar danos aos neurônios, muitos dos quais estão perto da superfície externa do tecido. Mostramos como um suporte especial que desenvolvemos é usado para estabilizar o cérebro na câmara de gravação. A eletrofisiologia padrão criado é usado para gravar a partir de neurônios individuais ou pares de neurônios. Uma imagem fluorescente, vistos através do microscópio de gravação, de uma linha de condução GAL4 expressão GFP (GH146) ilustra como os neurônios de projeção (PNs) são identificados no cérebro vivo. A imagem de alta potência Nomarski mostra uma visão de um único neurônio que está sendo alvo para gravação de células inteiras. Quando o cérebro é removido com sucesso sem danos, a maioria dos neurônios são espontaneamente ativos, disparando potenciais de ação e / ou exibindo entrada sináptica espontânea. Esta em preparação local, em que a gravação de células inteiras de neurônios identificados em todo o cérebro pode ser combinado com manipulações genéticas e farmacológicas, é um modelo útil para explorar fisiologia celular e plasticidade no SNC adulto.

Protocol

I. Dissecção de cérebros da mosca adulta Coloque uma pequena gota (~ mL 100) de dissecar solução no centro de uma placa de Petri 35 mm. Pegar fêmea adulta utilizando aspirador. Sob microscópio de dissecação, use duas agulhas de seringa para decapitar a voar. Cabeça no lugar uma pequena gota de solução salina de dissecação (com papaína adicionados) numa placa de Petri. Posição com cabeça com tromba de frente para fundo do prato. Segure a cutícula que co…

Discussion

A preparação do cérebro isolado todo ilustramos neste vídeo permite a avaliação dos mecanismos celulares subjacentes a excitabilidade ea transmissão sináptica em neurônios identificados, incluindo aqueles em vias de processamento olfativo, no adulto Drosophila cérebro (Gu e O Dowd, 2006). Esta abordagem é complementar ao estudo da atividade neuronal no cérebro de adultos intactos Drosophila (Wilson et all, 2004), em grande parte as gravações mesma forma dos neurônios em uma fatia do cérebro de mamíferos são complementares …

Materials

Material Name	Tipo	Company	Catalogue Number	Comment
#5 Foceps	Tool	FST by DUMONT	No. 11251-10	Be careful, never damage the fine tips of forceps
Papain	Reagent	Worthington	3126	20 U/ml activated by 1 mM L-cysteine
Dissecting microscope	SMZ-2B Model:C-PS	Nikon		Equipped with gooseneck fiber optic lights positioned a low angle
Needle & Syringe		PrecisionGlide®?, Becton Dickinson & Co	305175 & 309602	Cheap and durable
Upright microscope	Axioskop2 FS plus	Zeiss		Equipped with a fixed stage, 40X water immersion objective, Nomarski optics, and fluorescent lamp
Patch clamp amplifier	200 B	Molecular device
Digidata D-A converter	1322A	Molecular device