De protokoll som beskriver de viktigaste stegen för att få kristaller diffraktion kvaliteten på ett membranprotein efter beredning av proteinet i en lipidic kubisk fas (LCP), att hitta ursprungliga villkoren med LCP-FRAP före kristallisering analyser, upprättande av LCP kristallisering prövningar och skörd kristaller .
Membranproteiner utför viktiga funktioner i levande celler med anknytning till signaltransduktion, transport och transformationer energi, och som sådan är inblandade i en mängd störningar och sjukdomar. Det är dock en strukturell och funktionell förståelse av membranproteiner släpar kraftigt efter det att de lösliga partners, huvudsakligen beroende på svårigheterna förknippade med deras lösningsgörande och generering av kristaller diffraktion kvalitet. Kristallisering i lipidic mesophases (även känd som i meso eller LCP kristallisering) är en lovande teknik som framgångsrikt har använts för att med hög upplösning strukturer mikrobiell rhodopsins, fotosyntetiska proteiner, yttre membran fat beta och G-proteinkopplade receptorer. I meso kristallisering drar fördel av en infödd-liknande membran miljö och vanligtvis producerar kristaller med lägre halt av lösningsmedel och bättre beställning jämfört med traditionella kristallisation från tvättmedel lösningar. Metoden är inte svårt, men kräver en förståelse av lipid fas beteende och praxis i hantering av trögflytande mesophase material. Här visar vi ett enkelt och effektivt sätt att göra LCP och återuppbygga ett membran protein i membranet av LCP hjälp av en spruta mixer, följt av dosering metod i nanoliter delar av LCP i en analys eller kristallisering tallrik, genomföra före kristallisering analyser och skörd kristaller från LCP matrisen. Dessa protokoll ger en grundläggande guide för att närma sig i meso kristallisering försök, dock som med alla kristallisering experiment, omfattande screening och optimering krävs, och ett lyckat resultat är inte nödvändigtvis garanteras.
De protokoll som ger en grundläggande visuell vägledning för de viktigaste stegen i att uppträda i meso kristallisering experiment. Mer ingående detaljer med anknytning till dessa protokoll, med betoning på möjliga fallgropar, brister eller alternativa vägar finns tillgängliga någon annanstans 1,2. Valfri LCP-FRAP analyser kan hjälpa i tidigare skeden för att välja de mest lovande proteinet konstruera, LCP värd lipid och tillsatser lipid, samt begränsa de möjliga precipitants och villkor buffert 3. När en första kristallisering hit hittas, bör det vara optimerad för att få bättre kvalitet kristaller. Optimering av i meso kristallisering villkor i allt väsentligt liknar optimera förutsättningarna för lösliga proteiner med tillägg av extra parametrar som sammanhänger med sammansättningen av LCP 1. Membranprotein kristaller odlas i lipidic mesophase är oftast mindre i storlek än kristaller erhålls i rengöringsmedel, men beställde därmed strålrör drar nytta starkt från att använda mikrofokus finns på moderna synkrotron källor 6.
Många av de förfaranden för i meso kristallisering, inbegripet införande av kristallisering eller haltbestämning plattor, genomföra LCP-FRAP analyser och upptäcka kristaller, har halv-eller helautomatisk 1,2,8,9, vilket gör att screening av ett stort utbud av villkor samtidigt som den förbrukar små mängder protein och fett. Å andra sidan, protein reconstitutions i LCP och kristall skörd förblir manuella och mer tråkiga verksamheten och därmed har ett behov av förbättring.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete har finansierats i delar av NIH bidrag GM073197 och RR025336.
Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
100 μL gas-tight syringe | Hamilton | 7656-01 | 2 syringes are required | |
10 μL gas-tight syringe | Hamilton | 7653-01 | ||
Syringe coupler | Hamilton | 7770-02 30902 | The coupler can be made using available parts as described in refs. 10 | |
Repetitive syringe dispenser | Hamilton | 83700 | The repetitive syringe dispenser can be modified to reduce dispensing volume by ~3 times11 | |
Short (0.375”) flat-tipped removable needle (point style 3, gauge 26) | Hamilton | 7804-03 | ||
96-well glass sandwich plate | Marienfeld | 08 900 03 | For manual operations it is more convenient to assemble the glass sandwich plate using a standard microscope glass slides and a double sticky tape with punched holes1,2,12. | |
Glass cover slip | Electron Microscopy Sciences | 63787-01 | ||
monoolein | Sigma | M7765 | ||
Crystallization screens | Hampton Research, Molecular Dimensions, Emerald Biosystems, Jena Bioscience | Most of available commercial screens can be used for initial screening. Conditions that consistently disrupt LCP can be diluted 2x for better compatibility13. | ||
Capillary cutting stone | Hampton Research | HR4-334 | ||
Fine point tweezers | Ted Pella | 510 | ||
Angled sharp probe | Ted Pella | 13650 | ||
MicroMounts | MiTeGen | M1-Lxx-xx | Select MicroMount diameter to match the crystal size |