酵母のコロニーの埋め込み法
Summary
光および電子顕微鏡用切片可能に酵母のコロニーを埋め込むための方法。このプロトコルは、真菌、コミュニティ内での細胞型の組織を理解するための新しいツールを提供してコロニー内に胞子形成細胞と偽菌糸細胞の分布を決定することができます。
Abstract
胚の異なる細胞型のパターニングは、後生動物の発生において重要なメカニズムです。このようなコロニーやバイオフィルムのような微生物のコミュニティは、また、細胞の種類のパターンが表示されます。例えば、酵母のS.出芽酵母は 、胞子形成細胞と偽菌糸細胞が一様にコロニーで配布されていません。パターニングとこれらのパターンの根底にある分子機構の機能的重要性はまだよく理解されています。
真菌コロニーの細胞型のパターンを調査に関して、1つの課題は、後生動物の組織とは異なり、コロニー内の細胞は比較的弱く、お互いに接続されていることです。特に、真菌のコロニーはほとんどの組織に見られる細胞外マトリックスの同じ豊富なレベルが含まれていません。ここでは、これらのコロニーの細胞型の内部のパターンを明らかに酵母のコロニーを埋め込むとセクショニングの方法で報告する。方法は、光学顕微鏡および透過型電子顕微鏡に適した薄切片（0.1μ）のために有用（0.5μ）厚い切片を作製するために使用することができます。これらの細胞の内部構造はEMによって可視化することができますがASCIと偽菌糸の細胞が容易に、光学顕微鏡で卵形の酵母の細胞と区別することができます。
メソッドは、寒天でコロニーを囲むスパーの培地でそれらを浸潤し、切片に基づいています。 1〜2ミリメートルの範囲の直径を持つコロニーは、このプロトコルに適しています。コロニーの内部を可視化することに加えて、メソッドは基になる寒天に侵入するコロニーの領域を可視化できる。
Protocol
Discussion
提示方法は、コロニーの内部構造を明らかにする。方法は、Sの範囲内のセルのタイプのパターンを決定する上で効果的ですので、別のコロニーの形態を持つ、とも近縁種S. paradoxus 5の出芽酵母株は 、この方法はまた、真菌や他の微生物の広い範囲で動作する可能性があります。
メソッドの成功のための一つの重要なステップは、コロニーの?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
研究は、NIH 1R15GM094770によって資金を供給された。
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Osmium tetroxide | Electron Microscopy Sciences | RT 19152 | ||
| Silicone embedding molds | Fisher Scientific | NC 9975029 | ||
| Cycloaliphatic epoxide resin | Electron Microscopy Sciences | RT 15004 | ERL 4221 | |
| Epoxy resin | Electron Microscopy Sciences | RT 13000 | DER 736 | |
| Nonenyl Succinic Anhydride | Electron Microscopy Sciences | RT 19050 | NSA | |
| 2-Dimethyl aminoethanol | Electron Microscopy Sciences | RT 13300 | DMAE | |
| Mounting media | KPL | 71-00-16 | ||
| Rotating wheel | Ted Pella | Pelco 1055 | ||
| Microtome | Leica | Ultracut S |
Referências
- Kimmel, A. R., Firtel, R. A. Breaking symmetries: regulation of Dictyostelium development through chemoattractant and morphogen signal-response. Curr Opin Genet Dev. 14, 540-540 (2004).
- Palkova, Z., Vachova, L. Life within a community: benefit to yeast long-term survival. FEMS Microbiol Rev. 30, 806-806 (2006).
- Shapiro, J., Vachova, L. The significances of bacterial colony patterns. Bioessays. 17, 597-597 (1995).
- Shapiro, J., Vachova, L. Thinking about bacterial populations as multicellular organisms. Annu Rev Microbiol. 52, 81-81 (1998).
- Engelberg, D. Multicellular stalk-like structures in Saccharomyces cerevisiae. J Bacteriol. 180, 3992-3992 (1998).
- Scherz, R., Shinder, V., Engelberg, D. Anatomical analysis of Saccharomyces cerevisiae stalk-like structures reveals spatial organization and cell specialization. J Bacteriol. 183, 5402-5402 (2001).
- Piccirillo, S. The Rim101p/PacC pathway and alkaline pH regulate pattern formation in yeast colonies. Genética. 184, 707-707 (2010).
- Sniegowski, P. D., Dombrowski, P. G., Fingerman, E. Saccharomyces cerevisiae and Saccharomyces paradoxus coexist in a natural woodland site in North America and display different levels of reproductive isolation from European conspecifics. FEMS Yeast Res. 1, 299-299 (2002).
- Piccirillo, S., Honigberg, S. M. Sporulation patterning and invasive growth in wild and domesticated yeast colonies. Res Microbiol. 161, 390-390 (2002).
- Vachova, L. Architecture of developing multicellular yeast colony: spatio-temporal expression of Ato1p ammonium exporter. Environ Microbiol. , (2009).
