Colonia de levaduras Método de anidamiento
Summary
Un método para la incorporación de colonias de levadura que permite el corte de luz y microscopía electrónica. Este protocolo permite la determinación de la distribución de células y las células esporuladas pseudohyphal dentro de las colonias de proporcionar una nueva herramienta en la comprensión de la organización de los tipos de células dentro de una comunidad de hongos.
Abstract
Patrón de los diferentes tipos de células en embriones es un mecanismo clave en el desarrollo de los metazoos. Comunidades de microorganismos, tales como colonias y biofilms también muestran patrones de tipos de células. Por ejemplo, en el de levadura de S. cerevisiae, células y las células esporuladas pseudohyphal no están distribuidas uniformemente en las colonias. La importancia funcional de los patrones y los mecanismos moleculares que subyacen a estos modelos son aún poco conocidos.
Uno de los retos con respecto a la investigación de patrones de tipos de células en las colonias de hongos es que a diferencia del tejido metazoos, las células en las colonias son relativamente débilmente unidas entre sí. En particular, las colonias de hongos no contienen el mismo nivel amplio de la matriz extracelular en la mayoría de los tejidos. Aquí nos informe sobre un método para la inclusión y corte de colonias de levaduras que revela los patrones interior de tipos de células en estas colonias. El método puede ser usado para preparar secciones gruesas (0,5 μ) es útil para microscopía óptica y secciones delgadas (0,1 μ) adecuada para la microscopía electrónica de transmisión. Células ascos y pseudohyphal se pueden distinguir fácilmente de las células de levadura ovoide por microscopía de luz, mientras que la estructura interior de estas células puede ser visualizado por EM.
El método se basa en los alrededores de las colonias con agar, infiltrándose en ellos con el medio de Spurr, y luego el corte. Las colonias con un diámetro en el rango de 1-2 mm son adecuados para este protocolo. Además de visualizar el interior de las colonias, el método permite la visualización de la región de la colonia que invade el agar subyacente.
Protocol
Discussion
El método presentado revela las estructuras interiores de las colonias. Debido a que el método es eficaz en la determinación de patrones de tipos de células en una variedad de S. cerevisiae con morfologías diferentes colonias, y también en una especie relacionada S. paradoxus 5, el método también es probable que trabajar en una amplia gama de hongos y otros microorganismos.
Un paso fundamental para el éxito del método es asegurar que toda la colonia, incluyendo …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
La investigación fue financiada por el NIH 1R15GM094770.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Osmium tetroxide | Electron Microscopy Sciences | RT 19152 | ||
| Silicone embedding molds | Fisher Scientific | NC 9975029 | ||
| Cycloaliphatic epoxide resin | Electron Microscopy Sciences | RT 15004 | ERL 4221 | |
| Epoxy resin | Electron Microscopy Sciences | RT 13000 | DER 736 | |
| Nonenyl Succinic Anhydride | Electron Microscopy Sciences | RT 19050 | NSA | |
| 2-Dimethyl aminoethanol | Electron Microscopy Sciences | RT 13300 | DMAE | |
| Mounting media | KPL | 71-00-16 | ||
| Rotating wheel | Ted Pella | Pelco 1055 | ||
| Microtome | Leica | Ultracut S |
Referências
- Kimmel, A. R., Firtel, R. A. Breaking symmetries: regulation of Dictyostelium development through chemoattractant and morphogen signal-response. Curr Opin Genet Dev. 14, 540-540 (2004).
- Palkova, Z., Vachova, L. Life within a community: benefit to yeast long-term survival. FEMS Microbiol Rev. 30, 806-806 (2006).
- Shapiro, J., Vachova, L. The significances of bacterial colony patterns. Bioessays. 17, 597-597 (1995).
- Shapiro, J., Vachova, L. Thinking about bacterial populations as multicellular organisms. Annu Rev Microbiol. 52, 81-81 (1998).
- Engelberg, D. Multicellular stalk-like structures in Saccharomyces cerevisiae. J Bacteriol. 180, 3992-3992 (1998).
- Scherz, R., Shinder, V., Engelberg, D. Anatomical analysis of Saccharomyces cerevisiae stalk-like structures reveals spatial organization and cell specialization. J Bacteriol. 183, 5402-5402 (2001).
- Piccirillo, S. The Rim101p/PacC pathway and alkaline pH regulate pattern formation in yeast colonies. Genética. 184, 707-707 (2010).
- Sniegowski, P. D., Dombrowski, P. G., Fingerman, E. Saccharomyces cerevisiae and Saccharomyces paradoxus coexist in a natural woodland site in North America and display different levels of reproductive isolation from European conspecifics. FEMS Yeast Res. 1, 299-299 (2002).
- Piccirillo, S., Honigberg, S. M. Sporulation patterning and invasive growth in wild and domesticated yeast colonies. Res Microbiol. 161, 390-390 (2002).
- Vachova, L. Architecture of developing multicellular yeast colony: spatio-temporal expression of Ato1p ammonium exporter. Environ Microbiol. , (2009).
