Jäst Colony Bädda Metod
Summary
En metod för att bädda jäst kolonier möjliggör snittning för ljus-och elektronmikroskopi. Detta protokoll möjliggör bestämning av fördelningen av sporbildande celler och pseudohyphal celler i kolonierna som ger ett nytt verktyg till att förstå organisationen celltyper i en svamp gemenskap.
Abstract
Mönstring av olika celltyper i embryon är en viktig mekanism i flercelliga utveckling. Samhällen av mikroorganismer, såsom kolonier och biofilm visas också mönster av celltyper. Till exempel i jästen S. cerevisiae, är sporbildande celler och pseudohyphal celler inte jämnt fördelad i kolonier. Den funktionella betydelsen av mönstring och de molekylära mekanismer som ligger bakom dessa mönster är fortfarande dåligt kända.
En utmaning när det gäller att undersöka mönster av celltyper i svampkolonier är att till skillnad flercelliga vävnader, celler i kolonier relativt svagt knutna till varandra. I synnerhet innehåller svampkolonier inte samma omfattande grad av extracellulära matrix finns i de flesta vävnader. Här rapporterar vi om en metod för inbäddning och snittning jäst kolonier som avslöjar det inre mönster av celltyper i dessa kolonier. Metoden kan användas för att förbereda tjocka sektioner (0,5 μ) användbara för ljusmikroskopi och tunna sektioner (0,1 μ) lämplig för transmissionselektronmikroskopi. ASCI och pseudohyphal celler kan lätt skiljas från ovala jästceller med ljusmikroskop, medan den inre strukturen av dessa celler kan visualiseras av EM.
Metoden bygger på omgivande kolonier med agar, infiltrera dem med Spurr medellång och sedan snittning. Kolonier med en diameter i storleksordningen 1-2 mm är lämpliga för detta protokoll. Förutom att visualisera det inre av kolonierna, kan metoden visualisering i regionen av kolonin som invaderar den underliggande agar.
Protocol
Discussion
Metoden som presenteras visar det inre strukturer kolonier. Eftersom metoden är effektiv för att bestämma mönster av celltyper i en rad S. cerevisiae stammar med olika koloni morfologier, och även i en besläktad art S. paradoxus 5, är metoden också sannolikt att arbeta på ett brett spektrum av svamp och andra mikroorganismer.
Ett kritiskt steg för att lyckas med metoden är att se till att hela kolonin, bland annat toppen av kolonin, är inkapslad i agar hela pr…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forskningen har finansierats av NIH 1R15GM094770.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Osmium tetroxide | Electron Microscopy Sciences | RT 19152 | ||
| Silicone embedding molds | Fisher Scientific | NC 9975029 | ||
| Cycloaliphatic epoxide resin | Electron Microscopy Sciences | RT 15004 | ERL 4221 | |
| Epoxy resin | Electron Microscopy Sciences | RT 13000 | DER 736 | |
| Nonenyl Succinic Anhydride | Electron Microscopy Sciences | RT 19050 | NSA | |
| 2-Dimethyl aminoethanol | Electron Microscopy Sciences | RT 13300 | DMAE | |
| Mounting media | KPL | 71-00-16 | ||
| Rotating wheel | Ted Pella | Pelco 1055 | ||
| Microtome | Leica | Ultracut S |
Referências
- Kimmel, A. R., Firtel, R. A. Breaking symmetries: regulation of Dictyostelium development through chemoattractant and morphogen signal-response. Curr Opin Genet Dev. 14, 540-540 (2004).
- Palkova, Z., Vachova, L. Life within a community: benefit to yeast long-term survival. FEMS Microbiol Rev. 30, 806-806 (2006).
- Shapiro, J., Vachova, L. The significances of bacterial colony patterns. Bioessays. 17, 597-597 (1995).
- Shapiro, J., Vachova, L. Thinking about bacterial populations as multicellular organisms. Annu Rev Microbiol. 52, 81-81 (1998).
- Engelberg, D. Multicellular stalk-like structures in Saccharomyces cerevisiae. J Bacteriol. 180, 3992-3992 (1998).
- Scherz, R., Shinder, V., Engelberg, D. Anatomical analysis of Saccharomyces cerevisiae stalk-like structures reveals spatial organization and cell specialization. J Bacteriol. 183, 5402-5402 (2001).
- Piccirillo, S. The Rim101p/PacC pathway and alkaline pH regulate pattern formation in yeast colonies. Genética. 184, 707-707 (2010).
- Sniegowski, P. D., Dombrowski, P. G., Fingerman, E. Saccharomyces cerevisiae and Saccharomyces paradoxus coexist in a natural woodland site in North America and display different levels of reproductive isolation from European conspecifics. FEMS Yeast Res. 1, 299-299 (2002).
- Piccirillo, S., Honigberg, S. M. Sporulation patterning and invasive growth in wild and domesticated yeast colonies. Res Microbiol. 161, 390-390 (2002).
- Vachova, L. Architecture of developing multicellular yeast colony: spatio-temporal expression of Ato1p ammonium exporter. Environ Microbiol. , (2009).
