Live-imagerie de la translocation de la PKC dans les cellules Sf9 et dans les neurones sensoriels aplysie

Summary

Dans cette vidéo, nous démontrons la visualisation de la translocation de la PKC dans les cellules vivantes en utilisant PKC fluorescence marqués.

Abstract

La protéine kinase C (PKC) sont des sérine thréonine kinases qui jouent un rôle central dans la régulation d'une grande variété de processus cellulaires tels que la croissance cellulaire et de l'apprentissage et la mémoire. Il ya quatre familles connues des isoformes de la PKC chez les vertébrés: PKC classiques (α, ßi, βII et γ), le type de roman que je PKC (ε et η), le roman de type II PKC (δ et θ), et des PKC atypiques (ζ et ι ). La PKC classiques sont activés par le Ca ^{2 +} et diacylclycerol (DAG), tandis que le roman de PKC sont activées par le DAG, mais sont Ca ^{2 +-indépendante.} La PKC atypiques sont activés par Ca ^{2 +} ni, ni DAG. En Aplysia californica, notre système modèle pour étudier la formation de la mémoire, il ya trois système nerveux spécifiques isoformes de PKC un de chaque grande catégorie, à savoir le traditionnel PKC Apl I, le type de roman que je PKC Apl II et l'atypique PKC Apl III. PKC sont des lipides kinases activées et donc l'activation des PKC classiques et novatrices en réponse aux signaux extracellulaires a été fréquemment corrélée à la translocation de la PKC cytoplasme vers la membrane plasmique. Ainsi, en visualisant la translocation de la PKC dans le temps réel dans des cellules vivantes est devenu un outil précieux pour élucider les voies de transduction du signal qui conduisent à l'activation de PKC. Par exemple, cette technique a permis d'établir que différentes isoformes de la PKC translocation dans des conditions différentes de médiation types distincts de la plasticité synaptique et que la sérotonine (5HT) activation de la PKC Apl II nécessite la production de deux DAG et l'acide phosphatidique (PA) pour translocation ^1-2. Fait important, la capacité de visualiser le même neurone a à plusieurs reprises nous a permis, par exemple, pour mesurer la désensibilisation de la réponse de la PKC dans le détail exquis ^3. Dans cette vidéo, nous démontrons chaque étape de la préparation des cultures de cellules Sf9, des cultures de neurones sensoriels aplysie ont été décrites dans un autre article ⁴ vidéo, en exprimant PKC fluorescence marqués dans les cellules Sf9 et dans les neurones sensoriels aplysie et en direct de la translocation de la PKC imagerie en réponse à activateurs différents en utilisant le laser-microscopie à balayage.

Protocol

1. Préparation et entretien des cultures monocouche cellulaire Sf9 Sf9 culture cellulaire et de la maintenance est effectuée sous une hotte de culture de tissus. Les cellules Sf9 sont dérivées de cellules de Spodoptera frugiperda l'ovaire (cellules Sf21) et peut être acheté comme cellules congelées dans les médias Grace chez Invitrogen. Placer 8 ml de milieu d'insectes de Grace, complétées (1X), à laquelle 30% de sérum bovin fœtal (FBS) a été ajoutée dans u…

Discussion

Nous avons décrit une technique pour la translocation des PKC l'image par fluorescence marqués en temps réel dans des cellules Sf9 et dans les neurones sensoriels aplysie. Les cellules Sf9 de fournir un système simple à l'image de translocation de PKC, depuis la culture et de les transfecter est assez simple. En revanche, la micro-injection de neurones sensoriels aplysie prend un certain temps à maîtriser, jusqu'à quelques mois. Difficultés liées à cette technique comprennent col…

Materials

Material Name	Tipo	Company	Catalogue Number	Comment
Sf9 frozen cells	Spodoptera frugiperda ovarian cells	Invitrogen	B825-01
Grace’s Insect Medium, Supplemented (1X), liquid	Reagent	Gibco	11605-094	Use to culture Sf9 cells
Corning 75cm2 canted neck cell culture flask	Tool	Corning	430720	Use to culture Sf9 cells
Fetal Bovine Serum	Reagent	CanSera	CS-C08-500	Supplement Grace’s media with FBS prior to use
Syringe	Tool	Becton Dickinson	309604	Use to filter Fast Green solution
Syringe	Tool	Becton Dickinson	309602	Use to filter plasmid DNA / Fast Green solution
Filter	Tool	Corning	431229	Use to filter Fast Green solution
Filter	Tool	Corning	431212	Use to filter plasmid DNA / Fast Green solution
Glass Bottom Dish	Tool	Mattek	P35G-1.5-14-C	Use to culture Sf9 cells prior to transfection and imaging
Cellfectin II Reagent	Reagent	Invitrogen	10362-100	Used to express fluorescently tagged PKCs in Sf9 cells
Fast Green FCF	Reagent	Sigma-Aldrich	F-7252	Use to visualize microinjection of plasmid DNA solution into Aplysia sensory neurons
Thin wall glass capillaries	Tool	World Precision Instruments	TW100F-4	Use to make microelectrodes for microinjection
Microloader pipette tip	Tool	Eppendorf	CA32950-050	Autoclave before using to fill up the microelectrodes for microinjection
PV820 Pneumatic PicoPump	Tool	World Precision Instruments	SYS-PV820	Part of microinjection station
Microelectrode holder	Tool	World Precision Instruments	MPH6S	Use to hold microelectrode
Micromanipulator	Tool	Sutter	MP-85	Use to position microelectrode in the three-axis