Sf9細胞でとアメフラシ感覚ニューロンにおけるPKC転座のライブイメージング
Summary
このビデオでは、我々は、蛍光標識のPKCS使用して生きた細胞内PKC転座の可視化を実証する。
Abstract
プロテインキナーゼCS（PKCには）そのような細胞の成長と学習と記憶のような細胞プロセスの様々な調節において中心的役割を果たすスレオニンキナーゼセリンです。古典的PKCに（α、βI、βII、γ）、新規のI型は、PKCS（ε、η）、小説II型PKCの（δ、θ）、そして非定型PKCの（ζとι：脊椎動物におけるPKCアイソフォームの4つの既知の家族が暮らしている）。古典的なPKCSは、 カルシウムによって活性化されている小説のPKCがDAGにより活性化されるが、Ca 2 +の -独立している間に+とdiacylclycerol（DAG）、。非定型PKCには、Ca 2 +もDAGのどちらによって活性化されています。 アメフラシカリフォルニ 、記憶形成を研究する我々のモデルシステムでは、という三神経系特異的PKCアイソフォームの主要な各クラスから1つ、従来のPKC APL私、小説のI型PKC APL IIと非定型PKC APL IIIがあります。 PKCには、脂質活性化キナーゼであるため、細胞外シグナルに応答して、古典と小説PKCの活性化は、しばしば細胞質から形質膜へのPKC転座と相関している。そのため、生きた細胞でリアルタイムでPKCトランスロケーションを可視化するPKCの活性化につながるシグナル伝達経路を解明するための貴重なツールとなっています。私たちはシナプス可塑性の異なる型を媒介するため、異なる条件下で転位するPKCの、異なるアイソフォームを確立し、PKC APL IIの、セロトニン（5HT）アクティベーションのためのDAGとホスファチジン酸の両方の生産（PA）を必要とするために例えば、このテクニックは、許可されている転座1-2。重要なのは、同じニューロンを可視化する機能は、繰り返し私たちは、例えば、絶妙の詳細3におけるPKC応答の脱感作を測定することができました。このビデオでは、我々はSf9細胞培養の準備の各ステップを示す、 アメフラシ感覚ニューロンの培養物に反応してSf9細胞やアメフラシ感覚神経とPKC転座のライブイメージングの蛍光標識のPKCS発現する別のビデオの第4条に記載されているレーザー走査顕微鏡を用いて異なる活性剤。
Protocol
Discussion
我々は、Sf9細胞やアメフラシ感覚ニューロンのリアルタイムで蛍光標識PKCの画像の転座に手法を記載している。 Sf9細胞は、培養するため、画像PKC転座にシンプルなシステムを提供し、それらをトランスフェクトするのはとても簡単です。対照的に、 アメフラシ感覚ニューロンのマイクロインジェクションは、習得には時間がかかります。まで数カ月に。この技法に関連する問?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、ウェインS. Sossinに健康研究（CIHR）グラントのカナダの協会によってサポートされていました。キャロルA.ファラーはデラフォンルシェルシュエンサンテケベック（FRSQ）とコンラッドハリントンの交わりからポスドクの受信者です。著者は、グラフィックの概要とヘルプのためのビデオ撮影とマデリーンリッチモンドプールのヘルプはジョアンナブジー、マーガレットヘイスティングスとマーガレットLabbanに感謝します。
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Sf9 frozen cells | Spodoptera frugiperda ovarian cells | Invitrogen | B825-01 | |
| Grace’s Insect Medium, Supplemented (1X), liquid | Reagent | Gibco | 11605-094 | Use to culture Sf9 cells |
| Corning 75cm2 canted neck cell culture flask | Tool | Corning | 430720 | Use to culture Sf9 cells |
| Fetal Bovine Serum | Reagent | CanSera | CS-C08-500 | Supplement Grace’s media with FBS prior to use |
| Syringe | Tool | Becton Dickinson | 309604 | Use to filter Fast Green solution |
| Syringe | Tool | Becton Dickinson | 309602 | Use to filter plasmid DNA / Fast Green solution |
| Filter | Tool | Corning | 431229 | Use to filter Fast Green solution |
| Filter | Tool | Corning | 431212 | Use to filter plasmid DNA / Fast Green solution |
| Glass Bottom Dish | Tool | Mattek | P35G-1.5-14-C | Use to culture Sf9 cells prior to transfection and imaging |
| Cellfectin II Reagent | Reagent | Invitrogen | 10362-100 | Used to express fluorescently tagged PKCs in Sf9 cells |
| Fast Green FCF | Reagent | Sigma-Aldrich | F-7252 | Use to visualize microinjection of plasmid DNA solution into Aplysia sensory neurons |
| Thin wall glass capillaries | Tool | World Precision Instruments | TW100F-4 | Use to make microelectrodes for microinjection |
| Microloader pipette tip | Tool | Eppendorf | CA32950-050 | Autoclave before using to fill up the microelectrodes for microinjection |
| PV820 Pneumatic PicoPump | Tool | World Precision Instruments | SYS-PV820 | Part of microinjection station |
| Microelectrode holder | Tool | World Precision Instruments | MPH6S | Use to hold microelectrode |
| Micromanipulator | Tool | Sutter | MP-85 | Use to position microelectrode in the three-axis |
Referências
- Farah, C. A., Nagakura, I., Weatherill, D., Fan, X. &. a. m. p. ;. a. m. p., Sossin, W. S. Physiological role for phosphatidic acid in the translocation of the novel protein kinase C Apl II in Aplysia neurons. Mol Cell Biol. 28, 4719-4733 (2008).
- Zhao, Y., Leal, K., Abi-Farah, C., Martin, K. C., Sossin, W. S. &. a. m. p. ;. a. m. p., Klein, . M.Isoform specificity of PKC translocation in living Aplysia sensory neurons and a role for Ca2+-dependent PKC APL I in the induction of intermediate-term facilitation. J Neurosci. 26, 8847-8856 (2006).
- Farah, C. A., Weatherill, D., Dunn, T. W. &. a. m. p. ;. a. m. p., Sossin, W. S. PKC differentially translocates during spaced and massed training in Aplysia. J Neurosci. 29, 10281-10286 (2009).
- Zhao, Y., Wang, D. O., Martin, K. C. Preparation of Aplysia sensory-motor neuronal cell cultures. J Vis Exp. , (2009).
- Manseau, F., Fan, X., Hueftlein, T., Sossin, W. S., Castellucci, V. F. Ca2+-independent PKC Apl II mediates the serotonin induced facilitation at depressed synapses in Aplysia. J. Neuroscience. 21, 1247-1256 (2001).
