En vivo de imágenes de la translocación de PKC en células Sf9 y en las neuronas sensoriales Aplysia
Summary
En este vídeo, se demuestra la visualización de la translocación de la PKC en células vivas mediante PKC marcado con fluorescencia.
Abstract
La proteína quinasa C (PKC) son serina treonina cinasas que juegan un papel central en la regulación de una amplia variedad de procesos celulares, tales como el crecimiento celular y el aprendizaje y la memoria. Hay cuatro familias conocidas de las isoformas de PKC en los vertebrados: PKC clásicas (α, βI, βII y γ), el tipo de novela que PKC (ε y η), la novela de tipo II PKC (δ y θ), y PKC atípicas (ζ y ι ). La PKC clásicas son activados por Ca 2 + y diacylclycerol (DAG), mientras que las PKC nuevas son activadas por DAG, pero son Ca 2 +-independiente. Las PKC atípicas son activados por Ca 2 + ni ni DAG. En Aplysia californica, nuestro sistema modelo para estudiar la formación de la memoria, hay tres isoformas específicas del sistema nervioso PKC uno de cada clase principal, a saber, la PKC convencionales APL I, el tipo de novela que PKC Apl II y de la PKC atípicas APL III. PKC son lípido quinasas activadas y por lo tanto la activación de la PKC clásicas y nuevas en respuesta a señales extracelulares con frecuencia se ha correlacionado con translocación de PKC desde el citoplasma a la membrana plasmática. Por lo tanto, la visualización de la translocación de la PKC en tiempo real en células vivas se ha convertido en una herramienta invaluable para dilucidar las vías de transducción de señales que conducen a la activación de la PKC. Por ejemplo, esta técnica ha permitido que nos permite establecer que las diferentes isoformas de PKC trasladar bajo diferentes condiciones de mediar en distintos tipos de plasticidad sináptica y que la serotonina (5-HT) activación de la PKC Apl II requiere la producción de los DAG y ácido fosfatídico (PA) para translocación 01/02. Es importante destacar que la capacidad de visualizar la misma neurona en repetidas ocasiones nos ha permitido, por ejemplo, para medir la desensibilización de la respuesta de la PKC en exquisito detalle 3. En este vídeo, que muestran cada paso de la preparación de Sf9 cultivos celulares, cultivos de neuronas sensoriales Aplysia se han descrito en otro artículo de vídeo 4, expresando PKC marcado con fluorescencia en células Sf9 y en las neuronas sensoriales Aplysia y en vivo de imágenes de la translocación de PKC en respuesta a activadores diferentes utilizando microscopía de barrido láser.
Protocol
Discussion
Hemos descrito una técnica de translocación de PKC imagen marcado con fluorescencia en tiempo real en células Sf9 y en las neuronas sensoriales Aplysia. Sf9 proporcionar un sistema simple a la translocación de PKC imagen desde el cultivo y la transfección de ellos es bastante sencillo. Por el contrario, la microinyección de las neuronas sensoriales Aplysia toma algún tiempo para dominar, hasta unos pocos meses. Dificultades relacionadas con esta técnica son la obstrucción de los electrodos. Fi…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por los Institutos Canadienses de Investigación en Salud (CIHR) Otorgar a Wayne S. Sossin. Carole A. Farah es el beneficiario de una beca postdoctoral del Fonds de la Recherche en Santé du Québec (FRSQ) y una beca de Conrad Harrington. Los autores desean agradecer a Joanna Bugía, Hastings y Margaret Labban Margaret para recibir ayuda con la filmación del video y la piscina Madeline Richmond para ayudar con la descripción gráfica.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Sf9 frozen cells | Spodoptera frugiperda ovarian cells | Invitrogen | B825-01 | |
| Grace’s Insect Medium, Supplemented (1X), liquid | Reagent | Gibco | 11605-094 | Use to culture Sf9 cells |
| Corning 75cm2 canted neck cell culture flask | Tool | Corning | 430720 | Use to culture Sf9 cells |
| Fetal Bovine Serum | Reagent | CanSera | CS-C08-500 | Supplement Grace’s media with FBS prior to use |
| Syringe | Tool | Becton Dickinson | 309604 | Use to filter Fast Green solution |
| Syringe | Tool | Becton Dickinson | 309602 | Use to filter plasmid DNA / Fast Green solution |
| Filter | Tool | Corning | 431229 | Use to filter Fast Green solution |
| Filter | Tool | Corning | 431212 | Use to filter plasmid DNA / Fast Green solution |
| Glass Bottom Dish | Tool | Mattek | P35G-1.5-14-C | Use to culture Sf9 cells prior to transfection and imaging |
| Cellfectin II Reagent | Reagent | Invitrogen | 10362-100 | Used to express fluorescently tagged PKCs in Sf9 cells |
| Fast Green FCF | Reagent | Sigma-Aldrich | F-7252 | Use to visualize microinjection of plasmid DNA solution into Aplysia sensory neurons |
| Thin wall glass capillaries | Tool | World Precision Instruments | TW100F-4 | Use to make microelectrodes for microinjection |
| Microloader pipette tip | Tool | Eppendorf | CA32950-050 | Autoclave before using to fill up the microelectrodes for microinjection |
| PV820 Pneumatic PicoPump | Tool | World Precision Instruments | SYS-PV820 | Part of microinjection station |
| Microelectrode holder | Tool | World Precision Instruments | MPH6S | Use to hold microelectrode |
| Micromanipulator | Tool | Sutter | MP-85 | Use to position microelectrode in the three-axis |
Referências
- Farah, C. A., Nagakura, I., Weatherill, D., Fan, X. &. a. m. p. ;. a. m. p., Sossin, W. S. Physiological role for phosphatidic acid in the translocation of the novel protein kinase C Apl II in Aplysia neurons. Mol Cell Biol. 28, 4719-4733 (2008).
- Zhao, Y., Leal, K., Abi-Farah, C., Martin, K. C., Sossin, W. S. &. a. m. p. ;. a. m. p., Klein, . M.Isoform specificity of PKC translocation in living Aplysia sensory neurons and a role for Ca2+-dependent PKC APL I in the induction of intermediate-term facilitation. J Neurosci. 26, 8847-8856 (2006).
- Farah, C. A., Weatherill, D., Dunn, T. W. &. a. m. p. ;. a. m. p., Sossin, W. S. PKC differentially translocates during spaced and massed training in Aplysia. J Neurosci. 29, 10281-10286 (2009).
- Zhao, Y., Wang, D. O., Martin, K. C. Preparation of Aplysia sensory-motor neuronal cell cultures. J Vis Exp. , (2009).
- Manseau, F., Fan, X., Hueftlein, T., Sossin, W. S., Castellucci, V. F. Ca2+-independent PKC Apl II mediates the serotonin induced facilitation at depressed synapses in Aplysia. J. Neuroscience. 21, 1247-1256 (2001).
