바인딩 메커니즘을 결정하기 위해 가변 농도 등온 적정의 열량의 데이터 세트를 수집
Summary
ITC는 호스트에 리간드의 바인딩을 연구를위한 강력한 도구입니다. 복잡한 시스템에서 그러나, 몇 가지 모델은 동일하게 데이터를 맞을 수 있습니다. 방법은 여기에 설명된 것은 복잡한 시스템에 적합한 바인딩 모델을 명료하게하다와 해당 열역학적 파라미터를 추출하는 수단을 제공합니다.
Abstract
등온 적정의 열량 (ITC)는 일반적으로 호스트 macromolecule에 리간드의 바인딩과 관련된 열역학적 파라미터를 결정하는 데 사용됩니다. ITC는 호스트 / 리간드 상호 작용을 공부에 대한 일반적인 spectroscopic 방법을 통해 몇 가지 장점이 있습니다. 예를 들어, 공개 또는 두 구성 요소가 상호 작용할 때 흡수 열을 직접 측정 및 외인성 기자가 필요하지 않습니다. 따라서 바인딩 엔탈피 및 협회 상수 (카)가 직접 ITC 데이터에서 얻은되며, entropic 기여를 계산하는 데 사용할 수 있습니다. 또한, 등온선의 모양이 C – 가치와 관련된 기계론의 모델에 따라 달라집니다. C – 값으로 정의 C = N [P] tKa 어디로 [P] t는 단백질 농도이며, 여기서 n은 호스트 내에서 리간드 바인딩 사이트의 번호입니다. 대부분의 경우, 특정 리간드에 대해 여러 개의 바인딩 사이트가 아닌 동등하고 ITC는 개별 바인딩 사이트에 대한 열역학적 바인딩 매개 변수의 특성을 허용합니다. 이것은 그러나 올바른 바인딩 모델을 사용해야합니다. 다른 모델은 동일한 실험 데이터를 끼워 넣을 수있는 선택이 문제가 될 수 있습니다. 우리는 이전에이 문제가 C – 값 몇 가지의 실험을 수행하여 피할 수 것으로 나타났습니다. C – 값이 다른에서 얻은 여러 등온선은 별도의 모델을 동시에 맞게됩니다. 올바른 모델은 다음 전체 변수 – C의 데이터 세트에 걸쳐 적합의 장점을 기반으로 식별됩니다. 이 과정은 aminoglycoside 내성 유발 효소 aminoglycoside N – 6' – acetyltransferase – II (AAC (6 ') – II) 여기에 적용됩니다. 우리의 방법론은 어떤 시스템에 적용할 수 있지만,이 전략의 필요성은 더 allostery 또는 cooperativity를 보여주는 macromolecule – 리간드 시스템 시연, 그리고 다른 바인딩 모델은 동일한 데이터에 본질적으로 동일한 맞는를 제공하면됩니다. 우리의 지식, 상용 그런 시스템은 없습니다. AAC (6 ') – II는 두 subunits 사이 cooperativity을 보여주는이 활성화된 사이트를 포함하는 호모 – 이합체입니다. 그러나 C – 값이 하나에서 얻은 ITC 데이터는 적어도 두 가지 모델이 두 세트 – 오브 – 사이트 독립적인 모델과 두 사이트를 연속 (협동) 모델 똑같이 잘 맞지 수 있습니다. 위의 설명과 같이 C – 가치를 변화를 통해, 그것은 AAC에 대한 올바른 바인딩 모델 (6 ') – II는 두 사이트를 순차적으로 결합 모델입니다 설립되었습니다. 여기에, 우리는 ITC의 실험을 수행할 때 가변 C 분석에 적합한 데이터 세트를 얻기 위해 이동해야하는 단계를 설명합니다.
Protocol
Discussion
가변 C 피팅이 분석 부분은 이전에 자세하게 설명 10했습니다. 여기 우리는이 접근 방식에 적합한 가변 – C 데이터 세트를 수집 실용적인 측면을보고합니다. 그것은 모든 단백질과 리간드 샘플이 동일한 주식 솔루션에서 도출되는 중요합니다. 따라서 충분한 재고 솔루션 실험 시리즈 전체를 완료하는 데 처음에 준비하는 것이 중요합니다. 이것은 AAC의 비율 (6 ') – II를 보장하고 AcCoA 모든…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 캐나다 보건 연구소 연구 (CIHR), 국립 과학 및 공학 연구위원회 (NSERC), 그리고 CIHR 교육 교부금 장학금 (LF)를 지원했습니다. 우리는 AAC를위한 교수 제라드 D. 라이트 (맥매스터 대학, 캐나다) (6) – II의 표현이 플라스미드 감사합니다.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Acetyl coenzyme A (AcCoA) | Sigma-Aldrich | A2056 | ||
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Fisher | 7365-45-9 | ||
| ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | 431788 | ||
| Spectra/Por 2 Dialysis Tubing | Spectrum Labs | 132678 | ||
| Sterile Syringe Filter (0.2 μm) | VWR | 281445-477 | ||
| Cellulos Nitrate Membrane Filters (0.45 μm) | Whatman | 7184-004 | ||
| VP-ITC | MicroCal | VP-ITC | Microcalorimeter used for measurements | |
| ThermoVac | MicroCal | USB Thermo Vac | Temperature Controlled Degassing Station |
Referências
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