איסוף משתנה ריכוז מקורר באופן איזוטרמי Calorimetry טיטרציה מערכי נתונים על מנת לקבוע מנגנונים הכבילה
Summary
המרכז לטניס בישראל הוא כלי רב עוצמה ללימוד קשירת ליגנד לארח שלה. במערכות מורכבות עם זאת, מספר דגמים עשוי להתאים את הנתונים באותה מידה. השיטה המתוארת כאן מספק אמצעי על מנת להבהיר את מודל מחייב מתאים מערכות מורכבות לחלץ את פרמטרים תרמודינמיים המקביל.
Abstract
Calorimetry טיטרציה מקורר באופן איזוטרמי (ITC) משמש בדרך כלל כדי לקבוע פרמטרים תרמודינמיים הקשורים מחייב של ליגנד כדי מקרומולקולה המארח. המרכז לטניס בישראל יש כמה יתרונות על פני הגישות ספקטרוסקופיות משותף לחקר המארח / אינטראקציות ליגנד. לדוגמה, החום שוחררו או נספג כאשר שני המרכיבים אינטראקציה נמדדת ישירות ואינו דורש כל הכתבים אקסוגניים. לפיכך אנתלפיה מחייב את העמותה קבוע (קה) מתקבלים נתונים ישירות מן המרכז לטניס בישראל, והוא יכול לשמש כדי לחשב את התרומה entropic. יתר על כן, את הצורה של האיזותרמה תלויה ערך-c לבין מודל מכניסטית מעורב. C-ערך מוגדר c = n [טז] tKa, שם [טז] לא הוא ריכוז חלבון, n הוא מספר אתרי קשירה ליגנד בתוך הפונדקאי. במקרים רבים, אתרי הקישור מרובים עבור ליגנד מסוים הם לא שוות ערך המרכז לטניס בישראל מאפשר אפיון של פרמטרים תרמודינמיים מחייב עבור כל אתר קשירה יחיד. אולם זה דורש כי המודל מחייב נכונה לשמש. בחירה זו יכולה להיות בעייתית אם דגמים שונים יכולים להתאים את נתוני הניסוי אותו. הראינו בעבר כי בעיה זו ניתן לעקוף על ידי ביצוע ניסויים בכמה c-ערכים. איזותרמות מספר המתקבל שונה c-ערכים ראויים בו זמנית מודלים נפרדים. המודל הנכון הוא זיהה הבא מבוסס על בטוב להתאים לרוחב במערך את המשתנה-c כולו. תהליך זה מיושם כאן כדי aminoglycoside התנגדות גורמי aminoglycoside האנזים N-6'-acetyltransferase-II (AAC (6 ')-II). אף על פי המתודולוגיה שלנו הוא ישים לכל מערכת, הצורך של אסטרטגיה זו באה לידי ביטוי טוב יותר עם מערכת מקרומולקולה-ליגנד המראה allostery או cooperativity, וכאשר מודלים שונים מחייב לספק מתאים זהה במהותו אל אותם נתונים. למיטב ידיעתנו, אין מערכות כאלה זמינים מסחרית. AAC (6 ')-II, הוא הומו-דימר המכיל שני אתרים פעילים, מראה cooperativity בין שתי יחידות משנה. עם זאת נתוני המרכז לטניס בישראל להשיג בחנות אחת c-ערך יכול להיות מתאים באותה מידה לפחות שני דגמים שונים מודל עצמאי של שני סטים של אתרי וכן שני רציפים באתר (שיתופית) מודל. באמצעות שינוי c-ערך כפי שהוסבר לעיל, נקבע כי המודל הנכון עבור מחייב AAC (6 ')-II הוא מודל דו אתר הקישור רציפים. בזאת, אנו מתארים את הצעדים שיש לנקוט בעת ביצוע ניסויים המרכז לטניס בישראל על מנת לקבל ערכות נתונים מתאים משתנה ג ומנתחת.
Protocol
Discussion
חלק זה של הניתוח משתנה-c הולם תוארה בעבר בהרחבה 10. כאן אנו מדווחים על ההיבטים המעשיים של איסוף משתנה ג מערכי נתונים מתאים לגישה זו. זה חיוני כי כל חלבון דגימות ליגנד לקוחים הפתרונות מניות זהה. לכן חשוב כי המניה מספקת פתרון מוכן בתחילה כדי להשלים את הסדרה כולה של נ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מכוני הבריאות הקנדי מחקר (CIHR), הלאומית למדע וההנדסה מועצת המחקר (NSERC), וכן להעניק הכשרה CIHR מלגה (אל LF). אנו מודים פרופ 'ג'רארד ד רייט (אוניברסיטת מקמאסטר, קנדה) עבור AAC (6) II-פלסמיד ביטוי.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Acetyl coenzyme A (AcCoA) | Sigma-Aldrich | A2056 | ||
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Fisher | 7365-45-9 | ||
| ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | 431788 | ||
| Spectra/Por 2 Dialysis Tubing | Spectrum Labs | 132678 | ||
| Sterile Syringe Filter (0.2 μm) | VWR | 281445-477 | ||
| Cellulos Nitrate Membrane Filters (0.45 μm) | Whatman | 7184-004 | ||
| VP-ITC | MicroCal | VP-ITC | Microcalorimeter used for measurements | |
| ThermoVac | MicroCal | USB Thermo Vac | Temperature Controlled Degassing Station |
Referências
- Cliff, M. J., Ladbury, J. E. A survey of the year 2002 literature on applications of isothermal titration calorimetry. Journal of Molecular Recognition. 16, 383-391 (2003).
- Cliff, M. J., Gutierrez, A., Ladbury, J. E. A survey of the year 2003 literature on applications of isothermal titration calorimetry. Journal of Molecular Recognition. 17, 513-523 (2004).
- Ababou, A., Ladbury, J. E. Survey of the year 2004: literature on applications of isothermal titration calorimetry. Journal of Molecular Recognition. 19, 79-89 (2006).
- Ababou, A., Ladbury, J. E. Survey of the year 2005: literature on applications of isothermal titration calorimetry. Journal of Molecular Recognition. 20, 4-14 (2007).
- Okhrimenko, O. k. s. a. n. a., J, I. A survey of the year 2006 literature on applications of isothermal titration calorimetry. Journal of Molecular Recognition. 21, 1-19 (2008).
- Bjelic, S., Jelesarov, I. A survey of the year 2007 literature on applications of isothermal titration calorimetry. Journal of Molecular Recognition. 21, 289-312 (2008).
- Leavitt, S., Freire, E. Direct measurement of protein binding energetics by isothermal titration calorimetry. Current Opinion in Structural Biology. 11, 560-566 (2001).
- Wiseman, T., Williston, S., Brandts, J. F., Lin, L. -. N. Rapid measurement of binding constants and heats of binding using a new titration calorimeter. Analytical Biochemistry. 179, 131-137 (1989).
- Capaldi, S. The X-Ray Structure of Zebrafish (Danio rerio) Ileal Bile Acid-Binding Protein Reveals the Presence of Binding Sites on the Surface of the Protein Molecule. Journal of Molecular Biology. 385, 99-116 (2009).
- Freiburger, L. A., Auclair, K., Mittermaier, A. K. Elucidating Protein Binding Mechanisms by Variable-c ITC. ChemBioChem. 10, 2871-2873 (2009).
- Wybenga-Groot, L. E., Draker, K. -. a., Wright, G. D., Berghuis, A. M. Crystal structure of an aminoglycoside 6′-N-acetyltransferase: defining the GCN5-related N-acetyltransferase superfamily fold. Structure. 7, 497-507 (1999).
- Draker, K., Northrop, D. B., Wright, G. D. Kinetic Mechanism of the GCN5-Related Chromosomal Aminoglycoside Acetyltransferase AAC(6′)-Ii from Enterococcus faecium: Evidence of Dimer Subunit Cooperativity. Bioquímica. 42, 6565-6574 (2003).
- Wright, G. D., Ladak, P. Overexpression and characterization of the chromosomal aminoglycoside 6′-N-acetyltransferase from Enterococcus faecium. Antimicrob. Agents Chemother. 41, 956-960 (1997).
- MicroCal. . ITC Data Analysis in Origin. , (2004).
