Het verzamelen van variabele concentratie Isothermische Titration Calorimetrie Datasets om Binding mechanismen bepalen
Summary
ITC is een krachtig hulpmiddel voor het bestuderen van de binding van een ligand aan zijn gastheer. In complexe systemen kan echter verschillende modellen passen bij de gegevens even goed. De hier beschreven methode is een middel om de passende bindende model voor complexe systemen te helderen en pak de bijbehorende thermodynamische parameters.
Abstract
Isotherme titratie calorimetrie (ITC) wordt vaak gebruikt om de thermodynamische parameters die geassocieerd worden met de binding van een ligand aan een gastheer macromolecuul te bepalen. ITC heeft een aantal voordelen ten opzichte van gemeenschappelijke spectroscopische methoden voor het bestuderen van gastheer / ligand interacties. Bijvoorbeeld, is de warmte die vrijkomt of geabsorbeerd als de twee componenten communiceren direct gemeten en vereist geen exogene verslaggevers. Dus de binding enthalpie en de vereniging constant (Ka) zijn rechtstreeks verkregen uit ITC data, en kan gebruikt worden om de entropische bijdrage te berekenen. Bovendien is de vorm van de isotherm is afhankelijk van de c-waarde en de betrokken mechanistische model. De c-waarde wordt gedefinieerd als c = n [P] TKA, waar [P] t is de eiwitconcentratie, en n is het aantal ligandbinding sites binnen de gastheer. In veel gevallen, meerdere bindingsplaatsen voor een bepaalde ligand zijn niet gelijkwaardig zijn en ITC maakt de karakterisering van de thermodynamische binding parameters voor elke individuele bindingsplaats. Dit vereist echter dat de juiste binding model worden gebruikt. Deze keuze kan problematisch zijn als verschillende modellen kan passen dezelfde experimentele data. We hebben eerder aangetoond dat dit probleem kan worden omzeild door het uitvoeren van experimenten op verschillende c-waarden. De meervoudige isothermen verkregen bij verschillende c-waarden tegelijkertijd fit te scheiden modellen. Het juiste model is naast geïdentificeerd op basis van de goodness of fit over de gehele variabele-c dataset. Dit proces wordt hier toegepast op het aminoglycoside weerstand veroorzakende enzym aminoglycoside N-6'-acetyltransferase-II (AAC (6 ')-II). Hoewel onze methodiek is toepasbaar op elk systeem, is de noodzaak van deze strategie beter aangetoond met een macromolecuul-ligand met aanduiding van de allosterie of coöperativiteit, en wanneer verschillende bindende modellen bieden in wezen identiek past op dezelfde gegevens. Voor zover wij weten, zijn er geen dergelijke systemen commercieel beschikbaar. AAC (6 ')-II is een homo-dimeer met twee actieve sites, waarin coöperativiteit tussen de twee subeenheden. Maar ITC gegevens verkregen op een c-waarde kan even goed geschikt zijn om ten minste twee verschillende modellen een twee-sets-van-sites onafhankelijke model en een twee-site sequentiële (coöperatieve) model. Door het variëren van de c-waarde zoals hierboven uiteengezet, werd vastgesteld dat de juiste binding model voor AAC (6 ')-II is een twee-site sequentiële bindend model. Hierin beschrijven we de stappen die moeten worden genomen bij het uitvoeren van ICT-experimenten in om datasets die geschikt zijn voor een variabele-c-analyses te verkrijgen.
Protocol
Discussion
Dit analytische deel van de variabele c fitting is eerder in detail beschreven 10. Hier melden wij de praktische aspecten van het verzamelen van een variabele-c datasets die geschikt zijn voor deze aanpak. Het is essentieel dat alle eiwit en ligand monsters zijn afkomstig uit dezelfde stam oplossingen. Daarom is het belangrijk dat er voldoende voorraad oplossing in eerste instantie is bereid om de hele reeks van experimenten af te ronden. Dit zorgt ervoor dat de verhouding van de AAC (6 ')-II en AcC…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door de Canadese Institutes of Health Research (CIHR), National Science and Engineering Research Council (NSERC), en een CIHR training subsidie beurs (LV). Wij danken prof. dr. Gerard D. Wright (McMaster University, Canada) voor de AAC (6)-II expressie plasmide.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Acetyl coenzyme A (AcCoA) | Sigma-Aldrich | A2056 | ||
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Fisher | 7365-45-9 | ||
| ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | 431788 | ||
| Spectra/Por 2 Dialysis Tubing | Spectrum Labs | 132678 | ||
| Sterile Syringe Filter (0.2 μm) | VWR | 281445-477 | ||
| Cellulos Nitrate Membrane Filters (0.45 μm) | Whatman | 7184-004 | ||
| VP-ITC | MicroCal | VP-ITC | Microcalorimeter used for measurements | |
| ThermoVac | MicroCal | USB Thermo Vac | Temperature Controlled Degassing Station |
Referências
- Cliff, M. J., Ladbury, J. E. A survey of the year 2002 literature on applications of isothermal titration calorimetry. Journal of Molecular Recognition. 16, 383-391 (2003).
- Cliff, M. J., Gutierrez, A., Ladbury, J. E. A survey of the year 2003 literature on applications of isothermal titration calorimetry. Journal of Molecular Recognition. 17, 513-523 (2004).
- Ababou, A., Ladbury, J. E. Survey of the year 2004: literature on applications of isothermal titration calorimetry. Journal of Molecular Recognition. 19, 79-89 (2006).
- Ababou, A., Ladbury, J. E. Survey of the year 2005: literature on applications of isothermal titration calorimetry. Journal of Molecular Recognition. 20, 4-14 (2007).
- Okhrimenko, O. k. s. a. n. a., J, I. A survey of the year 2006 literature on applications of isothermal titration calorimetry. Journal of Molecular Recognition. 21, 1-19 (2008).
- Bjelic, S., Jelesarov, I. A survey of the year 2007 literature on applications of isothermal titration calorimetry. Journal of Molecular Recognition. 21, 289-312 (2008).
- Leavitt, S., Freire, E. Direct measurement of protein binding energetics by isothermal titration calorimetry. Current Opinion in Structural Biology. 11, 560-566 (2001).
- Wiseman, T., Williston, S., Brandts, J. F., Lin, L. -. N. Rapid measurement of binding constants and heats of binding using a new titration calorimeter. Analytical Biochemistry. 179, 131-137 (1989).
- Capaldi, S. The X-Ray Structure of Zebrafish (Danio rerio) Ileal Bile Acid-Binding Protein Reveals the Presence of Binding Sites on the Surface of the Protein Molecule. Journal of Molecular Biology. 385, 99-116 (2009).
- Freiburger, L. A., Auclair, K., Mittermaier, A. K. Elucidating Protein Binding Mechanisms by Variable-c ITC. ChemBioChem. 10, 2871-2873 (2009).
- Wybenga-Groot, L. E., Draker, K. -. a., Wright, G. D., Berghuis, A. M. Crystal structure of an aminoglycoside 6′-N-acetyltransferase: defining the GCN5-related N-acetyltransferase superfamily fold. Structure. 7, 497-507 (1999).
- Draker, K., Northrop, D. B., Wright, G. D. Kinetic Mechanism of the GCN5-Related Chromosomal Aminoglycoside Acetyltransferase AAC(6′)-Ii from Enterococcus faecium: Evidence of Dimer Subunit Cooperativity. Bioquímica. 42, 6565-6574 (2003).
- Wright, G. D., Ladak, P. Overexpression and characterization of the chromosomal aminoglycoside 6′-N-acetyltransferase from Enterococcus faecium. Antimicrob. Agents Chemother. 41, 956-960 (1997).
- MicroCal. . ITC Data Analysis in Origin. , (2004).
