Met behulp van Whole Mount In situ Hybridisatie aan Moleculaire Biologie en organismale Link

Summary

Whole mount<em> In situ</em> Hybridisatie (WISH) werd gebruikt in een hoger niveau undergraduate Vergelijkende gewervelde Biologie cursus in aanvulling op dissecties gewervelde dieren. Dit gaf de studenten de gelegenheid om genexpressie te bestuderen als anatomie, die de studie van moleculaire biologie en organismale binnen een cursus.

Abstract

Hele monteren in situ hybridisatie (WISH) is een veelgebruikte techniek in de moleculair-biologische laboratoria gebruikt om de genexpressie te bestuderen door de lokalisatie van specifieke mRNA transcripten binnen het gehele monteren exemplaar. Deze techniek (aangepast van Albertson en Yelick, 2005) werd gebruikt in een hoger niveau undergraduate Vergelijkende gewervelde Biology Laboratory klaslokaal op Syracuse University. De eerste twee derde van de gewervelde Vergelijkende Biologie practicum geeft studenten de mogelijkheid om de embryologie en anatomie van verschillende organismen die verschillende ongewervelde taxa in de eerste plaats via de traditionele dissecties en het gebruik van modellen te bestuderen. Het laatste deel van de cursus betrokken een innovatieve benadering van het onderwijs door middel van observatie anatomie van gewervelde ontwikkeling gebruik van moleculaire technieken, waarin WISH werd uitgevoerd op zebravis embryo's. Een heterozygoot fibroblast groei factor 8 een (fgf8a) mutant lijn, aas, werd gebruikt. Als gevolg van Mendeliaanse overerving, ace intercrosses geproduceerd wild type, heterozygote en homozygote ace/fgf8a mutanten in een verhouding 01:02:01. RNA probes met bekende uitdrukking patronen in de middellijn en de ontwikkeling van anatomische structuren, zoals het hart, de somieten, tailbud, myotoom, en de hersenen werden gebruikt. WISH werd uitgevoerd met behulp van zebravis bij de 13 somiet en prim-6 podia, met studenten het uitvoeren van de kleuring reactie in de klas. De studie van de zebravis embryo's in verschillende stadia van ontwikkeling gaf de studenten de mogelijkheid om te observeren hoe deze anatomische structuren veranderd ontogenie. Bovendien hebben sommige ace/fgf8a mutanten weergegeven oneigenlijk hart looping, en defecten in somiet en ontwikkeling van de hersenen. De studenten in dit lab observeerde de normale ontwikkeling van de verschillende orgaansystemen met behulp van zowel externe anatomie als genexpressie patronen. Zij hebben ook geïdentificeerd en beschreven embryo's tonen oneigenlijk anatomische ontwikkeling en gen-expressie (dat wil zeggen, vermeende mutanten).

Voor instructeurs bij instellingen die niet al in het bezit van de vereiste apparatuur en waar fondsen voor lab en vernieuwing van het curriculum beperkt zijn, kan de financiële kosten van de reagentia en apparaten een factor om te overwegen, evenals de tijd en de inspanning die nodig is van de kant van de instructeur, ongeacht de instelling. Toch, we beweren dat het gebruik van WISH in dit soort klaslokaal het laboratorium instelling kan een belangrijke schakel tussen ontwikkelings-genetica en anatomie te geven. Naarmate de technologie evolueert en de mogelijkheid om organismale ontwikkeling te bestuderen op moleculair niveau wordt makkelijker, goedkoper en steeds populairder, zijn veel evolutionair biologen, ecologen, fysiologen en wenden zich tot onderzoek strategieën op het gebied van de moleculaire biologie. Het gebruik van WISH in een vergelijkend gewervelde Biologie laboratorium klas is een voorbeeld van hoe moleculen en anatomie kunnen samenkomen binnen een cursus. Dit geeft bovenste niveau studenten de kans om moderne biologische onderzoekstechnieken, wat leidt tot een meer gediversifieerde onderwijs en de bevordering van de toekomstige interdisciplinair wetenschappelijk onderzoek de praktijk.

Protocol

1. Plasmide Transformatie van Target cDNA Deel I: Transformatie van plasmide (Duur: 3 uur plus een nacht incubatie) Warm SOC voedingsstof bouillon in een 42 ° C waterbad (500 pi per reactie) Dooi competente cellen op ijs Voeg 1 ui plasmide tot 25 uL competente cellen Plaats op ijs gedurende 20 minuten Heat shock cellen in 42 ° C waterbad gedurende 45 seconden Onmiddellijk plaats cellen op ijs gedurende 2 minuten Voeg 500 ul van 42 ° C voedingsstoffen bouillon aan elke flacon van cellen Schudden bij 37 ° C gedurende 2 uur bij 255 omwentelingen per minuut (rpm) Plaat 75 pi transformatie mix op Luria Bertani (LB) agar platen Incubeer de platen omgekeerd bij 37 ° C gedurende de nacht Deel II: E. coli Cultuur (Verplicht Tijd: 15 minuten plus een nacht incubatie) Voor elke reactie, aliquot 3 ml LB bouillon en 3 pi van 50 mg / ml ampicilline in een cultuur buis Schraap een bacterie kolonie van de agar plaat en toe te voegen aan elke cultuur buis Schud kweekbuizen bij 37 ° C bij 255 rpm 's nachts Deel III: Plasmide-Prep (Duur: 1,5 uur) Isoleer plasmide van girale culturen het gebruik van de 5-premier FastPlasmid Mini Kit (Catalog # 2300000) Om te controleren op de aanwezigheid van voorbereide plasmide, voert het DNA geëlueerd uit de kit op een 1% Tris-acetaat-EDTA (TAE) gel gekleurd met ethidiumbromide 2. In Situ DIG-gelabelde RNA-Probe Synthese Deel I: Linearisatie van plasmide (Verplicht Tijd: 2,5 uur) In een 1,5 mL microfugebuisje, te combineren: Bereid Plasmide 20 ml Restrictie-enzym * 2 mL Buffer ** 10 ml 10X Bovine Serum Albumine (BSA) 10 ml Diethyl Pyrocarbonate (DEPC) Water 58 ml 100 ml Incubeer bij 37 ° C gedurende 2 uur * Varieert met plasmide ** Varieert met restrictie-enzym Deel II: Transcriptie (Verplicht Tijd: 3 uur) In een 1,5 mL microfugebuisje, te combineren: Lineaire plasmide 4 mL 10X Transcriptie Buffer ** 4 mL Digoxigenine Label Mix 4 mL Polymerase * 2 mL RNase Inhibitor 2 mL DEPC Water 24 ml 40 ml Incubeer bij 37 ° C gedurende 1 uur Voeg 2 ul van polymerase * Incubeer bij 37 ° C gedurende 1 uur Voeg 2 ul van DNase Incubeer bij 37 ° C gedurende 20 minuten * Varieert met plasmide ** Varieert met polymerase Deel III: Neerslag (Benodigde tijd: 5 minuten plus 2 uur tot 's nachts incubatie, 1 uur naar centrifuge en resuspendeer) Voeg 4 ul van 0,2 M EDTA Voeg 5 ul van 4M lithiumchloride Voeg 150 ul van ijskoude 100% ethanol Incubeer bij -80 ° C gedurende 2 uur om 's nachts Centrifugeer bij 14.000 rpm gedurende 30 minuten bij 4 ° C, giet af supernatant Droge pellet voor 7 minuten Re-schorten in 20 uL DEPC water Incubeer bij 37 ° C gedurende 5 minuten Deel IV: Fractionation – alleen uitvoeren als probe grootte is groter dan 0,6 kb (Duur: varieert op basis van probe grootte, meestal niet meer dan 20 minuten) In een 1,5 mL microfugebuisje, te combineren: RNA Probe 20 ml DEPC Water 12 ml Natriumbicarbonaat 4 mL Natriumcarbonaat 4 mL 40 ml Incubeer in een 60 ° C waterbad. Basis van de incubatietijd van de vergelijking: Tijd (min.) = (vanaf kb – gewenste kb) / (0,11 x vanaf kb x gewenste kb) Gemiddelde gewenste size = 0,6 kb Deel V: Final Neerslag (Benodigde tijd: 5 min.nuten plus 2 uur tot 's nachts incubatie, 1 uur naar centrifuge en resuspendeer, 1 uur voor gelelektroforese) Voeg 40 ul DEPC water Voeg 8 ul Natriumacetaat Voeg 1,04 ul ijsazijn Voeg 240 ul ijskoude 100% ethanol Incubeer bij -80 ° C gedurende 2 uur om 's nachts Centrifugeer bij 14.000 rpm gedurende 30 minuten bij 4 ° C, giet af supernatant Droge pellet voor 7 minuten Re-schorten in 20 uL DEPC water Vortex te mengen Om te controleren op de aanwezigheid van riboprobe, voer het opnieuw opgehangen oplossing op een 1% TAE gel gekleurd met ethidiumbromide 3. Hele berg in situ hybridisatie Deel I: Fixatie van embryo's en Proteinase K Spijsvertering (Tijd Vereist: Fix 's nachts plus vier uur de volgende dag voor de opslag, 2,5 uur van opslag naar deel II) Verzamel geënsceneerde zebravis embryo's en 's nachts vast te stellen in 4% paraformaldehyde (PFA) bij 4 ° C Was vast embryo's in fosfaat gebufferde zoutoplossing die 0,1% Tween-20 (PBST) 3 keer voor 10 minuten elk Om de blootstelling van de embryo's om de experimentele reagentia, handmatig dechorionate embryo's (indien nodig) met behulp van fijne punt pincet zorgen Uitdrogen embryo's door wassen in een gegradeerde serie van 25% en 50% methanol in PBST gedurende een uur elke wasbeurt, op te slaan in 100% methanol bij -20 ° C Wanneer klaar voor gebruik, hydrateren embryo's in PBST door wassen in 50% (2 maal) en 25% (1 keer) methanol in PBST gedurende 10 minuten elk. Tot slot was twee keer voor 10 minuten elk in 100% PBST. Exacte timing is niet belangrijk voor PBST / methanol wast Bleach embryo's in een 10% waterstofperoxide-oplossing in PBST, indien nodig, donkere pigmenten te verwijderen. Embryo's broeden in waterstofperoxide-oplossing voor 10-20 minuten, afhankelijk van de leeftijd van het embryo, en de dop van de microfugebuis moet open blijven voor-opbouw te voorkomen van de luchtdruk Digest embryo's met 50 mg / ml proteïnase K verdund 1:5000 in PBST voor 3-15 minuten, afhankelijk van de leeftijd van het embryo Re-fix embryo's in 4% PFA gedurende 30 minuten, en daarna wassen 3 keer in PBST gedurende 5 minuten per Deel II: Hybridisatie van riboprobes (Duur: 3 uur plus 's nachts voor hybridisatie, 1,5 uur de volgende dag naar deel III) Prehybridize embryo's met prehybridisatie oplossing (PHS) in een voorverwarmde 70 ° C waterbad gedurende 2-3 uur Verwijder de PHS, voeg 0,5 ml hybridisatie-oplossing en 1,5 pi eerder gesynthetiseerd digoxigenine gelabeld riboprobes, incuberen bij 70 ° C gedurende de nacht. De temperatuur kan schommelen binnen een paar graden, afhankelijk van de riboprobe doel De volgende dag, wassen embryo's bij 70 ° C in gegradeerde oplossingen van 75%, 50% en 25% PHS in 2X zoutoplossing-natriumcitraat (SSC) voor 10 minuten elk, daarna wassen in 0,2 X SSC gedurende 30 minuten bij 68 ° C Was in maleïnezuur Buffer (MAB) 2 keer voor 10 minuten elk bij kamertemperatuur Deel III: Anti-digoxigenine (α-DIG) antilichaam Incubatie (Duur: 3 uur plus 's nachts te blokkeren, 2,5 uur de volgende dag naar deel IV) Transfer embryo's om een ​​12 wells plaat Pre-block embryo's in 1-2 mL oplossing voor het blokkeren van minimaal 3 uur bij kamertemperatuur Tegelijkertijd, pre-blok het antilichaam door het opstellen van een tweede deel van het blokkeren van oplossing en verdunnen van de anti-digoxigenine antilichaam 1:2000 in deze oplossing Verwijder de pre-block en voeg 1-2 ml pre-geblokkeerde α-DIG-oplossing, overnachting incuberen bij 4 ° C De volgende dag, wassen embryo's in MAB. Laat de embryo's in MAB incubeer gedurende 5 minuten, daarna voer een buffer verandert en incubeer gedurende 10 minuten twee, een 30 minuten en een 60 minuten interval. Exacte timing is niet nodig Was de embryo drie keer voor vijf minuten elk in alkalische fosfatase (AP) buffer Deel IV: Beitsen en nabewerking (Duur: 1 uur tot 's nachts voor vlekken, afhankelijk van de gebruikte riboprobe, kan vier uur tot het begin van glycerol wast, 6-10 uur per glycerol wassen, worden opgeslagen in glycerol) Voeg 1-2 ml kleuroplossing om de embryo's, wikkel de plaat in folie en controleer vlekken op regelmatige tijdstippen (ongeveer om de 20 minuten) tot kleuring is voldoende Was de embryo's met PBST 2 keer voor 5 minuten om de kleuring reactie te stoppen Uitdrogen embryo's met behulp van 10 minuten wast in 25% (1 keer) en 50% (2 keer) methanol in PBST, dan is in 100% methanol, op de achtergrond te verwijderen vlekken Laat embryo's in 100% methanol incubeer gedurende minstens 2 uur bij kamertemperatuur Hydrateren in PBST met behulp van 10 minuten wast in 50% (2 maal) en 25% (1 keer) methanol in PBST, daarna wassen in 100% PBST twee keer Overdracht gebrandschilderde embryos tot een 80% glycerol oplossing in PBST, met behulp van een getrapte reeks van wast, en bewaar bij 4 ° C. Recepten: LB agar platen-10 g LB-agar + 250 ml gedestilleerd water, autoclaaf, bij koel aan toe te voegen 250 uL ampicilline, giet 15-20 ml warme oplossing in elke petrischaal, laat agar stollen LB bouillon-12,5 g LB bouillon + 200 ml gedestilleerd water, autoclaaf, laat afkoelen voor gebruik 1% TAE gel-0.4 g agarose, 40 ml 1x TAE, 2 pL ethidiumbromide; belasting zeven pi plasmide (Plasmide Transformatie van Target cDNA) of 3 pi riboprobe en 4 pi DEPC water (in situ DIG-gelabelde RNA-Probe Synthesis) + 1 ui laden kleurstof, 5 ul DNA-ladder Prehybridisatie oplossing-50% formamide, 5x SSC, 9.2mM citroenzuur, 1% Tween-20 Hybridisatie-oplossing-prehybridisatie oplossing plus 500 ug / ml tRNA en 50 ug / ml heparine MAB-100mm maleïnezuur, 150mm NaCl, 0,2 M NaOH, 0,1% Tween-20, pH tot 7,5 Het blokkeren van Solution-3 delen MAB, 1 deel 10% Boehringer het blokkeren van reagens in MAB, een deel warmte gedeactiveerd lam serum AP buffer-60mm Tris-HCl pH 9,5, 60mm NaCl, 30mm MgCl 2, 0,1% Tween-20 Kleuroplossing-5-broom-4-chloor-3-indolyl fosfaat (BVIE) en Nitro blauw tetrazolium (NBT) in AP buffer 4. Representatieve resultaten Wanneer deze wordt uitgevoerd correct, zal de reactie tussen de NBT, BCIP, en alkalische fosfatase vormen een paarse neerslag die moet op de zebravis embryo verschijnen als een paarse vlek. Riboprobes moet eerder worden gesynthetiseerd uit cDNA dat correspondeert met het gen van belang. Daarom kan worden geconcludeerd enige smet gevisualiseerd vertegenwoordigt gebieden van de zebravis, waarin het gen van belang is getranscribeerd op die bepaalde ontwikkelingsfase. Voor de toepassing van deze cursus werden riboprobes gesynthetiseerd uit aldh1a2 (voorheen raldh2; Begemann et al., 2001;. Figuur 1); fgf8a (Reifers et al., 1998;. Figuur 2); deltaC (Oates et al., 2005.); myod1 (Weinberg et al., 1996.) shha (. Krauss et al., 1993), pax2a (Brand et al., 1996;. figuur 3) en myl7 (voorheen cmlc2;. Yelon et al., 1999) cDNA. Kleuring werd verwacht in de middellijn en in de anatomische structuren met inbegrip van de somieten, tailbud, myotoom, hersenen en het hart. Ace/fgf8a mutanten werd verwacht dat ze gebreken in veel van deze structuren. Kleuring werd makkelijk kunnen worden gevisualiseerd met behulp van een standaard dissectiemicroscoop. Aanvullende bronnen bevatten meer informatie en het oplossen van problemen aan de wensen van technieken die vergelijkbaar zijn met de hier beschreven (Clark, 2003;. D'Costa et al., 2009; Schmoldt et al., 2009;. Schoenwolf, 2009). Figuur 1. Een zebravis embryo 24 uur na de bevruchting, die is gehybridiseerd met riboprobes specifiek voor aldh1a2. Specifieke kleuring is te zien in de ogen, achterhersenen, borstvin knop primordia, en somieten. Anterior is naar de top, posterior is naar de bodem. Figuur 2. Een zebravis embryo bij de 13 somiet stadium van de ontwikkeling die is gehybridiseerd met een probe specifiek voor fgf8a. Specifieke kleuring is te zien in de telencephalon, dorsale diencephalon, middenhersenen-achterhersenen grens, somieten, en tailbud. Ventraal is naar links, dorsale is aan de rechterkant. Figuur 3. A 22 uur na de bevruchting zebravis embryo dat is gehybridiseerd met een riboprobe specifiek voor pax2a, een robuuste marker nuttig voor het visualiseren van het zenuwstelsel. Specifieke kleuring kan worden gezien in het vaatvlies spleet, middenhersenen-achterhersenen grens, Otic blaasje, en het ruggenmerg neuronen. Dorsale bekijken met anterior aan de linkerkant.

Discussion

WISH werd gebruikt in een vergelijkend gewervelde Biologie practicum om studenten te helpen de rol van genetica in anatomische ontwikkeling te begrijpen door het visualiseren van bekende genexpressie patronen. Voor het eerste deel van de cursus, de studenten uitgevoerd dissecties op organismen die verschillende ongewervelde taxa, waardoor ze ruim de tijd om te studeren, te begrijpen, te vergelijken, en het contrast gewervelde anatomie.

Als inleiding op het tweede deel van de cursus, waren studenten krijgen een hoorcollege beschreven ontwikkeling van de zebravis en anatomie. De methoden en verwachte resultaten van de wens experiment werden ook besproken. Studenten werden dan gegeven levende zebravis op somitogenesis en prim-6 stadia van ontwikkeling, en op 2 en 5 dagen na de bevruchting (DPF) te onderzoeken onder de microscoop te ontleden. Dit was om de studenten een beter begrip van wat zebravis embryo's eruit zien en de aard van de morfologische veranderingen die zich voordoen over ontogenie.

In de volgende laboratorium sessie werden de studenten gegeven zebravis embryo's, waarin WISH eerder was uitgevoerd. Ze werden gevraagd te bestuderen en de genexpressie patronen te beschrijven voor elk gen van belang (riboprobe gebruikt). Embryo's die voor WISH waren afkomstig van kruisingen tussen leden van een heterozygote ace/fgf8a lijn. Op basis van Mendeliaanse overerving, werd 25% van de embryo's uit de ace/fgf8a paringen zal naar verwachting worden homozygote mutanten en defecten vertonen in veel van de anatomische structuren gericht op het in deze cursus. Gebaseerd op gepubliceerde rapporten en niet-gepubliceerde waarnemingen in de Albertson lab, werden gebreken in de hersenen en het oneigenlijke het hart looping verwacht, evenals gebreken aan de somieten (Brand et al., 1996;. Albertson en Yelick, 2005; persoonlijke observaties).

De studenten werd gevraagd om alle exemplaren, wild-type (heterozygote dieren zijn niet te onderscheiden van wild type broers en zussen in een vroeg stadium van ontwikkeling) en homozygote mutanten te onderzoeken, voor elk gen gepresenteerde expressie patroon. Zij werden vervolgens gevraagd naar het laboratorium van rapporten beschrijven hun resultaten schrijven en op basis van hun kennis van de anatomie en genetica, hoe defecte gen expressie kan anatomische afwijkingen hebben neergeslagen.

Studenten leek dit laboratorium te oefenen met spanning en nieuwsgierigheid te ontvangen. De meesten hadden nog nooit gebruikt WISH voor en waren zeer geïnteresseerd in dit deel van de cursus. Studenten de verschillende patronen van genexpressie te vinden in de zebravis embryo's intrigerende, sommigen zelfs beschreef de kleurpatronen gevisualiseerd door ze te associëren met bekende ontwerpen en symbolen, zoals een smiley gezicht. De resulterende lab rapporten bleek dat de studenten had een algemeen begrip van de wens protocol en de expressie van genen in specifieke anatomische structuren. Studenten werden ook verplicht om de specifieke functies van de genen te begrijpen bestudeerd met behulp van WISH tijdens het lab (Stickney et al., 2000;. Huelsken et al., 2002;. Geetha-Loganathan et al., 2008a;.. Geetha-Loganathan et al., 2008b ). Het was duidelijk echter dat bepaalde studenten beperkte achtergrond kennis van de signaalwegen en genen van interesse had. Meer informatie over deze concepten in het WISH inleidende lezing kan een welkome aanvulling op het gebruik van WISH in de toekomst Vergelijkende gewervelde Biologie cursussen.

Aangezien het protocol over het algemeen duurt vier opeenvolgende dagen, afhankelijk van het schema van de cursus kan de student slechts in staat zijn om een ​​deel van het experiment in de klas en de instructeur moet verantwoordelijk zijn voor de rest af te ronden. In onze vergelijkende gewervelde biologie klas, studenten de vlekken reacties in het laboratorium, terwijl de student-assistent verricht alle voorgaande stappen. Als het de voorkeur van de Studenten voeren WISH in de klas hebben, kan het protocol worden verdeeld in onderafdelingen die kunnen worden uitgevoerd over meerdere laboratorium sessies, afhankelijk van het tijdsbestek van de klas. Als het niet haalbaar is voor studenten om de hele protocol uit te voeren, zoals het was hier te wijten aan het lab vergadering slechts een keer een week kunnen studenten de kleuroplossing toe te voegen aan het begin van de les en, afhankelijk van de gebruikte riboprobe, hebben de kleuring te voltooien binnen een uur. De tijd die het duurt voor de vlek te ontwikkelen varieert sterk met elkaar riboprobe en een verscheidenheid aan experimentele condities en moet vooraf worden bepaald voor de les. Met name indien studenten alleen zal de vlek in het lab te ontwikkelen, zal instructeurs verantwoordelijk zijn voor alle voorgaande stappen, wat veel tijd en moeite buiten het klaslokaal vereist. Indien gewenst, kan een korter alternatief WISH worden immunohistochemie, met behulp van antilichamen labels aan eiwit lokalisatie te visualiseren, maar op dit moment, zebravis-specifieke antilichamen voor ontwikkelingsstoornissen genen zijn niet direct beschikbaar. Een andere optie zou zijn om WISH uit te voeren op verschillende gewervelde diersoorten eennd hebben de studenten de expressiepatronen van dezelfde genen te vergelijken in verschillende organismen (Pizard et al., 2004;. Aramaki et al., 2007;. Emerging modelorganismen, 2008; Emerging modelorganismen, 2010).

Het overkoepelende doel van het gebruik van WISH in een vergelijkend gewervelde Biologie cursus was om de leerlingen laten zien hoe moleculaire biologische technieken worden gebruikt om de anatomische ontwikkeling te bestuderen. Het bood ook een mogelijkheid voor studenten om te speculeren over hoe veranderde genexpressie kan leiden niet alleen tot ontwikkeling misvormingen, maar ook voor evolutionaire verandering. Geformaliseerd als evolutionaire ontwikkelingsbiologie (vaak aangeduid als "evo-devo"), deze snel groeiende vakgebied is gericht op genotype en fenotype koppelen door middel van ontwikkeling, en om potentiële mechanistische basis van evolutionaire verandering te helderen. Met de opkomst van dit gebied zijn meer ecologen, organismale biologen en fysiologen gebruik moleculaire technieken in hun onderzoek. We betogen dat het gebruik van de wens van in een vergelijkend Vertebrate Biologie cursus zal helpen om het curriculum up-to-date met de huidige technologische en conceptuele vorderingen in het onderzoek, en een betere horizontale uitlijning van de bovenste niveau biologie cursussen te vergemakkelijken door het combineren van biological deelgebieden. Bovendien zal deze geïntegreerde benadering bieden studenten de mogelijkheid om een ​​assortiment van biologisch onderzoek technieken te leren in een cursus, wat leidt tot een meer gediversifieerde onderwijs en de bevordering van de toekomstige interdisciplinair wetenschappelijk onderzoek.

Materials

Material Name	Tipo	Company	Catalogue Number	Comment
5 Prime Fast Plasmid Mini Kit (100 preps)		Fisher	2300000
One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli with SOC Medium		Invitrogen	C404003
LB Agar		Fisher	BP1425-500
LB Broth		Fisher	BP1426-500
Ampicillin Sodium Salt		Fisher	BP1760-5
Isopropanol		Acros	42383-0010
Petri Dish 100 x 20 mm non treated		Laboratory Products Sales	430591
14 ml Culture Tube, Snap Top		Fisher	1495911B
Restriction Enzymes & Buffers & 10xBSA		New England Bio Labs	varies
Diethyl Pyrocarbonate (DEPC) 25 ml		Sigma	D5758-25mL
Sodium Acetate Trihydrate USP/FCC 500g		Fisher	s608500
Gal 200 proof Ethyl alcohol		Fisher	04-355-451
Tris-Acetate-EDTA (TAE) 50x Sol 1L		Fisher	bp13321
Agarose Low EEO 100 g		Fisher	BP160-100
Ethidium Bromide 10 ml		Sigma	45-E1510
Sucrose Gel Loading Dye 40% Sucrose		Fisher	BP655-1
1 kb Full Scale DNA Ladder		Fisher	BP2582200
DIG RNA Labeling Mix		Roche	11277073910
T3 RNA Polymerase		Roche	1031163
T7 RNA Polymerase		Roche	10881767001
SP6 RNA Polymerase		Roche	810274
Protector Rnase Inhibitor		Roche	3335399001
Dnase I, Rnase Free 10,000 units		Roche	4716728001
EDTA molecular biology reagent		Sigma	e5134-500G
Lithium Chloride 100 g		Fisher	L121100
Sodium Carbonate 1 kg		Fisher	BP357-1
Sodium Bicarbonate, 500 g		Fisher	BP328-500
Acetic Acid glacial ACS 500 ml		Fisher	a38500
Paraformaldehyde R 500 g		Fisher	o4042500
PBS Phosphate Buffer Saline 10X		Fisher	bp3991
Tween 20 500 ml		Fisher	bp337500
Methanol 5 L		Fisher	A4124
Proteinase K 50 mg		Fisher	bp170050
Formamide 1 L		Fisher	F841
20x SSC 1 L		Fisher	bp13251
Citric Acid Anhydrous ACS 500 g		Fisher	a940500
Ribonucleic acid transfer type V		Sigma	r7876-2.5KU
Heparin Sodium salt 50 mg		Fisher	bp252450
Maleic acid R 500 g		Fisher	o3417500
Sodium Chloride 500 g		Fisher	s271500
Sodium Hydroxide 500 g		Fisher	s318500
Blocking Reagent		Roche	11096176001
Lamb Serum 500 ml		Invitrogen	16070096
Anti DIG AP fragments		Roche	11093274910
2M Tris Solution 500 ml		Fisher	bp1759500
Magnesium Chloride 500 g		Fisher	m33500
BCIP 3 ml		Roche	11383221001
NBT 3 ml		Roche	11383213001
Glycerol 99% 2.5 L		Fisher	AC158920025
Plate 12 well PS ST w/Lid		VWR	62406-165
Tube 15 ml screw cap 50/rack 500/cs		Laboratory Products Sales	L262861
Tube 50 ml screw cap 25/rack 500/cs		Laboratory Products Sales	L262890
1.6 ml microfuge tube		Laboratory Products Sales	L234401
2 Parafilm 2″ x 250 ft		Fisher	s37441
Transfer Pipet 7 ml		USA Scientific	1020-2520
.1-10 μl Pipet Tip, Bulk		USA Scientific	1111-3000
1-200 μl Pipet Tip, Bulk		USA Scientific	1111-0006
101-1000 μl Pipet Tip, Bulk		USA Scientific	1111-2021
Aluminum Foil		Grocery Store

• Autoclave
• Micro-centrifuge
• 37°C incubator (with shaker)
• 4°C micro-centrifuge
• Water bath
• Vortex
• Gel electrophoresis apparatus
• -20°C freezer
• -80°C freezer
• Rocker/shaker
• 4°C refrigerator
• Dissecting microscope (preferably with a teaching screen or camera)