Utilisation Mont entier<em> In situ</emHybridation> Lien vers biologie moléculaire et Organismal

Summary

Mount ensemble<em> In situ</emHybridation> (WISH) a été utilisé dans un cours de premier cycle supérieure comparée des vertébrés Biologie, en plus de vertébrés dissections. Cela a donné aux étudiants la possibilité d'étudier l'expression des gènes ainsi que l'anatomie macroscopique, qui relie l'étude de la biologie moléculaire et organismique au sein d'un cours.

Abstract

Mount toute hybridation de situ (WISH) est une technique courante dans les laboratoires de biologie moléculaire utilisées pour étudier l'expression des gènes par la localisation des transcrits d'ARNm spécifiques dans spécimen de montage ensemble. Cette technique (adapté de Albertson et Yelick, 2005) a été utilisé dans une salle de classe de premier cycle supérieure comparée des vertébrés de laboratoire de biologie à l'Université de Syracuse. Les deux premiers tiers du parcours laboratoire biologie comparative des vertébrés a donné aux étudiants l'occasion d'étudier l'embryologie et anatomie de plusieurs organismes représentant divers taxons chordés principalement par des dissections traditionnels et l'utilisation de modèles. La dernière partie du cours impliquait une approche novatrice de l'enseignement anatomie grâce à l'observation du développement des vertébrés en utilisant des techniques moléculaires dans lesquels WISH a été effectuée sur des embryons de poisson zèbre. Un facteur de croissance de 8 fibroblastes hétérozygote une ligne (fgf8a) mutant, as, a été utilisé. En raison de Mendelia héritage n, as croisements produit de type sauvage, hétérozygote, et les mutants homozygotes ace/fgf8a dans un rapport 1:2:1. Sondes d'ARN avec des profils d'expression connus de la ligne médiane et dans le développement de structures anatomiques tels que le cœur, les somites, bourgeon caudal, myotome et le cerveau ont été utilisés. WISH a été réalisée en utilisant le poisson zèbre au somite 13 et prim-6 étapes, avec des étudiants effectuant la réaction de coloration en classe. L'étude des embryons de poisson zèbre à des stades différents de développement a donné aux étudiants la possibilité d'observer la façon dont ces structures anatomiques changé au cours ontogenèse. En outre, certains mutants ace/fgf8a affiché en boucle cardiaque irrégulier et les défauts de somite et le développement du cerveau. Les étudiants de ce laboratoire ont observé le développement normal des divers organes et systèmes utilisant à la fois l'anatomie externe ainsi que l'expression des gènes. Ils ont également identifié et décrit les embryons présentant développement anatomique et une mauvaise expression des gènes (c.-à-mutants putatifs).

ontenu "> Pour les instructeurs dans les établissements qui ne possèdent déjà le matériel nécessaire ou lorsque des fonds pour le laboratoire et l'innovation curriculaires sont limitées, le coût financier des réactifs et l'appareillage peut être un facteur à considérer, comme le temps et les efforts nécessaires à la partie de l'instructeur, indépendamment du réglage. Néanmoins, nous soutenons que l'utilisation de WISH dans ce type d'environnement de laboratoire de classe peut fournir un lien important entre la génétique du développement et de l'anatomie. Comme la technologie progresse et la capacité à étudier le développement organismique au niveau moléculaire devient plus facile, moins cher et de plus en plus populaire, de nombreux biologistes évolutionnistes, les écologistes, physiologistes et se tournent vers des stratégies de recherche dans le domaine de la biologie moléculaire. Utilisation SOUHAITEZ dans une classe laboratoire de biologie comparative des vertébrés est un exemple de comment les molécules et l'anatomie peuvent converger dans un seul cours. Cela donne supérieures des étudiants de niveau collégial la possibilité de pratiquer modernes res biologiquesearch techniques, conduisant à une formation plus diversifiée et la promotion de l'avenir de la recherche scientifique interdisciplinaire.

Protocol

1. Transformation du plasmide cible d'ADNc Partie I: Transformation du plasmide (Temps requis: 3 heures plus une nuit d'incubation) Chaud SOC bouillon nutritif dans un bain de 42 ° C de l'eau (500 pi par réaction) Décongeler les cellules compétentes sur la glace Ajouter 1 ul de plasmide à 25 uL des cellules compétentes Placez-les sur de la glace pendant 20 minutes Cellules de choc thermique dans 42 salle de bain ° C de l'eau pendant 45 secondes Placez immédiatement les cellules sur de la glace pendant 2 minutes Ajouter 500 ul de 42 ° C bouillon nutritif à chaque flacon de cellules Agiter à 37 ° C pendant 2 heures à 255 rotations par minute (rpm) Plaque 75 ul mélange de transformation sur le milieu Luria Bertani (LB) des plaques d'agar Incuber inversé à 37 ° C pendant la nuit Partie II: E. Culture coli (Temps requis: 15 minutes, plus une nuit d'incubation) Pour chaque réaction,aliquote de 3 ml de bouillon LB et 3 ul de 50 mg / ml d'ampicilline dans un tube de culture Grattez 1 colonie de bactéries de la plaque d'agar et ajouter à chaque tube de culture Agiter les tubes de culture à 37 ° C à 255 tours par minute pendant la nuit Partie III: Préparation du plasmide (Temps requis: 1,5 heures) Isoler plasmide de cultures d'une nuit en utilisant le 5 Kit Premier Mini FastPlasmid (catalogue # 2300000) Pour vérifier la présence de plasmide préparé, exécutez l'ADN élué de la trousse à raison de 1% de Tris-Acétate-EDTA (TAE) Gel coloré au bromure d'éthidium 2. In Situ DIG-ARN marqué la sonde de synthèse Partie I: La linéarisation du plasmide (Temps requis: 2,5 heures) Dans un tube de 1,5 ml, mélanger: Préparé plasmide 20 ml * Restriction Enzyme </td> 2 ml Tampon ** 10 ml 10X albumine bovine sérique (BSA) 10 ml Pyrocarbonate de diéthyle (DEPC) Eau 58 ml 100 ml Incuber à 37 ° C pendant 2 heures * Varie avec le plasmide ** Varie avec l'enzyme de restriction Partie II: transcription (Temps requis: 3 heures) Dans un tube de 1,5 ml, mélanger: Le plasmide linéaire 4 ml Tampon de transcription 10X ** 4 ml Label Mix digoxigénine 4 ml * Polymérase 2 ml RNase Inhibitor 2 ml L'eau DEPC 24 ml 40 ml Incuber à 37 ° C pendant 1 heure Ajouter 2 ul de polymerase * Incuber à 37 ° C pendant 1 heure Ajouter 2 ul de DNase Incuber à 37 ° C pendant 20 minutes * Varie avec le plasmide ** Varie en fonction de la polymérase Partie III: Précipitations (Temps requis: 5 minutes plus 2 heure à une nuit d'incubation, 1 heure à centrifuger et remettre en suspension) Ajouter 4 ul de 0,2 M EDTA Ajouter 5 ul de chlorure de lithium 4M Ajouter 150 ul d'éthanol à 100% de la glace froide Incuber à 80 ° C pendant 2 heures ou toute la nuit Centrifuger à 14000 rpm pendant 30 minutes à 4 ° C, décanter le surnageant loin Séchez à granulés pendant 7 minutes Remettre en suspension dans 20 ul d'eau DEPC Incuber à37 ° C pendant 5 minutes Partie IV: Fractionnement – Effectuer seulement si la taille de la sonde est supérieure à 0,6 kb (Temps nécessaire: Varie en fonction de la taille de la sonde, généralement pas plus de 20 minutes) Dans un tube de 1,5 ml, mélanger: Sonde ARN 20 ml L'eau DEPC 12 ml Bicarbonate de sodium 4 ml Carbonate de sodium 4 ml 40 ml Incuber dans un bain d'eau à 60 ° C. Baser le temps d'incubation sur l'équation: Temps (min.) = (à partir ko – souhaité ko) / (0,11 x à partir ko x souhaité ko) Moyenne taille désirée = 0,6 kb Partie V: Précipitations final (Temps requis: 5 minnutes plus 2 heure à une nuit d'incubation, 1 heure à centrifuger et remettre en suspension, 1 heure pour électrophorèse sur gel) Ajouter 40 ul d'eau DEPC Ajouter 8 ul d'acétate de sodium Ajouter 1,04 ul d'acide acétique glacial Ajouter 240 ul de glace froide éthanol à 100% Incuber à 80 ° C pendant 2 heures ou toute la nuit Centrifuger à 14000 rpm pendant 30 minutes à 4 ° C, décanter le surnageant loin Séchez à granulés pendant 7 minutes Remettre en suspension dans 20 ul d'eau DEPC Vortex pour mélanger Pour vérifier la présence de ribosonde, exécutez la solution re-suspendu sur un gel coloré TAE 1% au bromure d'éthidium 3. Mont toute hybridation in situ Partie I: Fixation des embryons et la protéinase K Digestion (Temps requis: Correction heures de nuit majoré de 4 le lendemain pour le stockage, 2,5 heures de stockage à la partie II) Recueillir mise en scène embryons de poisson zèbre et le fixer à 4% parformaldéhyde (PFA) pendant une nuit à 4 ° C Laver embryons fixes en tampon phosphate salin contenant 0,1% de Tween-20 (PBST) 3 fois pendant 10 minutes chacun Pour assurer que l'exposition des embryons à des réactifs de laboratoire, les embryons manuellement dechorionate (si nécessaire) en utilisant une pince à pointe fine Déshydrater embryons par lavage dans une série graduée de 25% et 50% de methanol dans du PBST pendant une heure chaque lavage, puis stocker dans le méthanol à 100% à -20 ° C Lorsque vous êtes prêt à utiliser, réhydrater les embryons dans du PBST par un lavage à 50% (2 fois) et 25% (1 fois) méthanol dans du PBST pendant 10 minutes chacun. Enfin laver 2 fois pendant 10 minutes chacun dans du PBST 100%. Le calendrier exact n'est pas important pour PBST / méthanol lavages Embryons de blanchiment dans une solution de peroxyde d'hydrogène à 10% dans du PBST, si nécessaire, pour éliminer les pigments noirs. Les embryons doivent incuber dans une solution de peroxyde d'hydrogène pendant 10-20 minutes, en fonction de l'âge de l'embryon, et le bouchon du tube de centrifugeuse doit rester ouvert afin d'éviter l'accumulation d'airpression Recueil des embryons de 50 mg / ml protéinase K diluée à 1:5000 dans du PBST pendant 3-15 minutes, en fonction de l'âge de l'embryon Re-fix embryons en PFA à 4% pendant 30 minutes, puis laver 3 fois dans du PBST pendant 5 minutes de chaque Partie II: L'hybridation des ribosondes (Temps requis: 3 heures et nuit à l'hybridation, 1,5 heure le lendemain à la partie III) Prehybridize embryons avec une solution de pré-hybridation (PHS) dans un four préchauffé à 70 ° C eaux bain pendant 2-3 heures Retirer PHS, ajouter 0,5 ml de solution d'hybridation et 1,5 uL précédemment synthétisés digoxigénine ribosondes étiquetés, incuber à 70 ° C pendant la nuit. La température peut varier de quelques degrés en fonction de la cible ribosonde Le lendemain, lavez embryons à 70 ° C dans des solutions graduées de 75%, 50% et 25% PHS en 2X solution saline de citrate de sodium (SSC) pendant 10 minutes chacun, puis laver à 0,2 X SSC pendant 30 minutes à 68 ° C <li wash> dans le tampon acide maléique (MAB) 2 fois pour 10 minutes chacune à la température ambiante Partie III: Anti-digoxigénine (DIG-α) d'incubation d'anticorps (Temps requis: 3 heures et nuit à bloquer, 2,5 heures le lendemain de la partie IV) Transfert d'embryons à une plaque à 12 puits Pré-bloc embryons dans une solution de blocage 1-2 ml pendant au moins 3 heures à température ambiante Simultanément, avant de bloquer la préparation d'anticorps par un deuxième volume de solution de blocage et de dilution de l'anticorps anti-digoxigénine 1:2000 dans cette solution Retirer pré-bloc et ajouter 1-2 ml pré-bloqué α-DIG solution, incuber une nuit à 4 ° C Le lendemain, lavez les embryons in MAB. Laissez les embryons en incubation dans du MAB pour 5 premières minutes, puis effectuez les modifications de tampon et incuber pendant deux 10 minutes, une de 30 minutes et un intervalle de 60 minutes. Le calendrier exact n'est pas nécessaire Laver 3 fois les embryons pendant 5 minutes chaque in phosphatase alcaline (AP) tampon Partie IV: La coloration et le traitement final (Temps requis: 1 heure à une nuit pour la coloration, selon la ribosonde utilisé, 4 heures à début de lavages glycérol, 6-10 heures par cycle de lavage, le glycérol peut être stockée dans de la glycérine) Ajouter 1-2 ml de solution de coloration des embryons, enveloppez-le dans du papier plaque, et vérifier la coloration à intervalles réguliers (environ toutes les 20 minutes) jusqu'à ce que la coloration est suffisante Laver embryons avec du PBST 2 fois pendant 5 minutes chacun pour arrêter la réaction de coloration Déshydrater embryons en utilisant 10 lavages minute 25% (1 heure) et 50% (2 fois) méthanol dans du PBST, puis dans le méthanol à 100%, pour enlever les taches de fond Laissez embryons à incuber dans du méthanol à 100% pendant au moins 2 heures à la température ambiante Réhydrater en utilisant PBST 10 lavages minute 50% (2 fois) et 25% (1 fois) méthanol dans du PBST, puis lavez à 100% PBST 2 fois Transfert électronique teintémbryos à une solution de glycérol à 80% dans du PBST, en utilisant une série graduée de lavages, et conserver à 4 ° C. Recettes: Plaques de gélose LB-10 gélose LB + 250 g ml d'eau distillée, autoclave, lorsqu'elles sont froides au toucher ajouter 250 ul d'ampicilline, versez 15-20 ml de solution chaude dans chaque boîte de Pétri, gélose permettent de solidifier Bouillon LB-12.5 bouillon LB + 200 g ml d'eau distillée, autoclave, laisser refroidir avant de l'utiliser 1% TAE gel d'agarose 0,4 g, 40 ml TAE 1X, 2 ul de bromure d'éthidium; charge 7 pl plasmide (plasmide de transformation de la cible d'ADNc) ou 3 et 4 ribosonde ul ul d'eau DEPC (En synthèse DIG marqué in situ d'ARN Probe) + 1 colorant de charge pL, 5 pl échelle d'ADN Préhybridation solution-50% de formamide, 5X SSC, 9.2mm acide citrique, 1% de Tween-20 Hybridation solution de pré-hybridation solution plus 500 pg / ml d'ARNt et 50 pg / ml d'héparine MAB-100 mM d'acide maléique, 150 mM NaCl, NaOH 0,2 M, 0,1% de Tween-20, le pH à 70.5 Blocking Solution-3 pièces MAB, 1 pièce 10% de réactif Boehringer blocage dans MAB, 1 partie de la chaleur désactivé agneau sérum Tampon AP-60 mM Tris-HCl pH 9,5, 60 mM NaCl, 30 mM MgCl 2, 0,1% de Tween-20 Coloration Solution-5-Bromo-4-chloro-3-indolyle (BCIP) et Nitro bleu de tétrazolium (NBT) en tampon AP 4. Les résultats représentatifs Quand elle est réalisée correctement, la réaction entre le NBT, CBPI, et la phosphatase alcaline se former un précipité violet qui doit figurer sur l'embryon de poisson zèbre comme une tache pourpre. Ribosondes doit être préalablement synthétisé à partir de l'ADNc correspondant au gène d'intérêt. Par conséquent, on peut conclure toute tache représente visualiser les zones du poisson zèbre dans lequel le gène d'intérêt a été transcrit à ce stade de développement particulier. Pour les besoins de ce cours, ribosondes ont été synthétisés à partir de aldh1a2 (anciennement raldh2; Begemannet al, 2001;. Figure 1); fgf8a (Reifers et al, 1998;. Figure 2); Deltac (Oates et al, 2005);. MyoD1 (Weinberg et al, 1996);. SHHA (Krauss et al,. 1993), pax2a (Brand et al, 1996;. Figure 3) et myl7 (anciennement cmlc2;. Yelon et al, 1999) ADNc. La coloration a été prévu sur la ligne médiane et dans les structures anatomiques, y compris les somites, bourgeon caudal, myotome, le cerveau et le cœur. Ace/fgf8a mutants étaient censés avoir des défauts dans la plupart de ces structures. La coloration a été facilement visualisées avec un microscope standard dissection. Autres sources contiennent plus d'informations sur le dépannage et SOUHAITEZ des techniques similaires à celles décrites ici (Clark, 2003; D'Costa et al, 2009;. Schmoldt et al, 2009;. Schoenwolf, 2009). Figure 1. A emb poisson zèbreryo 24 heures après la fécondation, ce qui a été hybridée avec ribosondes spécifiques pour aldh1a2. Le marquage spécifique peut être vu dans les yeux, rhombencéphale, pectorale nageoire bourgeon primordia, et somites. Est antérieure à la partie supérieure, postérieure est au fond. Figure 2. Un embryon de poisson zèbre à l'étape 13 somites de développement qui a été hybridé avec une sonde spécifique pour fgf8a. La coloration spécifique est vu dans le télencéphale, diencéphale dorsal, le mésencéphale-rhombencéphale limite, somites, et bourgeon caudal. Ventrale est à gauche, dorsale est à droite. La figure 3. A 22 heures après la fertilisation embryon de poisson zèbre qui a été hybridé avec une sonde ribonucléique spécifique pour pax2a, un marqueur solide utile pour la visualisation du système nerveux. Le marquage spécifique peut être seen dans la fissure choroïde, le mésencéphale-rhombencéphale limite, vésicule otique, et les neurones de la moelle épinière. Vue dorsale d'avant à gauche.

Discussion

WISH a été utilisé dans un cours de laboratoire biologie comparative des vertébrés afin d'aider les élèves à comprendre le rôle de la génétique dans le développement anatomique grâce à la visualisation des profils d'expression génique connus. Pour la première partie du cours, les élèves ont exécuté des dissections sur les organismes représentant plusieurs taxons différents chordés, ce qui leur permet amplement de temps pour étudier, comprendre, comparer, et l'anatomie des vertébrés contraste.

En guise d'introduction à la deuxième partie du cours, les étudiants ont donné une conférence formelle décrivant développement du poisson zèbre et l'anatomie. Les méthodes et les résultats attendus de l'expérience WISH ont également été discutées. Les élèves ont ensuite eu le poisson-zèbre en direct à somitogenèse et prim-6 stades de développement, et à 2 et 5 jours après la fécondation (dpf) d'examiner à la loupe binoculaire. Il s'agissait de donner aux étudiants une meilleure compréhension de ce embryons de poisson zèbre ressemble et les types de changements morphologiques qui se produisent over l'ontogenèse.

Lors de la séance de laboratoire suivant, les élèves ont reçu embryons de poisson zèbre dans lequel WISH avaient déjà été effectuées. On leur a demandé d'étudier et de décrire les profils d'expression génique pour chaque gène d'intérêt (ribosonde utilisé). Embryons utilisés pour WISH ont été obtenues à partir de croisements entre les membres d'une lignée hétérozygote ace/fgf8a. Sur la base de l'hérédité mendélienne, 25% des embryons issus des croisements ace/fgf8a devaient être des mutants homozygotes et à présenter des défauts dans la plupart des structures anatomiques ont porté sur ce cours. Selon les rapports publiés et les observations non publiées dans le laboratoire Albertson, des défauts dans le cerveau et le coeur en boucle incorrecte étaient attendus, ainsi que les défauts dans les somites (Brand et al, 1996;. Albertson et Yelick, 2005; observations personnelles).

Les étudiants ont été invités à examiner tous les échantillons, de type sauvage (animaux hétérozygotes sont indiscernables des frères et sœurs de type sauvageaux premiers stades de développement) et des mutants homozygotes pour chaque profil d'expression génique présenté. Ils ont ensuite été invités à rédiger des rapports de laboratoire décrivent leurs résultats, et en fonction de leur connaissance de l'anatomie et de la génétique, comment l'expression des gènes défectueux peuvent avoir précipité malformations anatomiques.

Les élèves semblaient recevoir cet exercice de laboratoire avec enthousiasme et curiosité. La plupart n'avaient jamais utilisé SOUHAITEZ avant et ont été très intéressés par cette partie du cours. Les élèves ont trouvé les différents modes d'expression des gènes dans les embryons de poisson zèbre intrigants, certaines tendances décrites même la coloration visualisé en les associant avec de grands dessins et symboles, comme un visage souriant. Les rapports de laboratoire ont montré résultant des étudiants avaient une compréhension générale du protocole WISH et l'expression de gènes spécifiques dans des structures anatomiques. Les étudiants ont également besoin de comprendre les fonctions spécifiques des gènes étudiés en utilisant le souhaitez durant le laboratoire (Stickney et al, 2000;. Huelsken et al, 2002;. Geetha-Loganathan et al, 2008a;. Geetha-Loganathan et al, 2008b).. Il est évident cependant que certains élèves avaient des connaissances de base limitée des voies de signalisation et de gènes d'intérêt. Plus d'informations sur ces concepts dans le SOUHAITEZ cours d'introduction peut être une addition bienvenue à l'utilisation de WISH dans les futurs cours de biologie comparée des vertébrés.

Depuis le protocole prend généralement quatre jours consécutifs, selon le calendrier du cours, les étudiants ne peuvent être en mesure d'effectuer une partie de l'expérience en classe et l'instructeur doit être responsable pour le reste. Dans notre classe de biologie comparée des vertébrés, les élèves de la réaction de coloration en laboratoire, tandis que l'Assistant d'enseignement effectué toutes les étapes précédentes. Si il est préférable de demander aux élèves de réaliser SOUHAITEZ en classe, le protocole peut être divisé en sous-unités qui peuvent être effectuées sur l'artlusieurs séances de laboratoire, selon le calendrier de la classe. Si ce n'est pas possible pour les étudiants d'effectuer l'ensemble du protocole, comme il était ici en raison de la réunion de laboratoire seulement une fois par semaine, les élèves peuvent ajouter la solution de coloration au début de la classe et, en fonction de la ribosonde utilisé, le marquage complet moins d'une heure. Le temps qu'il faut pour que la tache de mettre au point varie considérablement d'un ribosonde et une variété de conditions expérimentales, et doit être déterminée avant la classe. Notamment, si les élèves ne sera développer la tache dans le laboratoire, les instructeurs sera responsable de toutes les étapes précédentes, ce qui nécessitera beaucoup de temps et d'efforts à l'extérieur de la classe. Si vous le souhaitez, une alternative plus courte à WISH pourrait être immunohistochimie, en utilisant des étiquettes d'anticorps de visualiser la localisation des protéines, mais à cette époque, le poisson zèbre anticorps spécifiques pour les gènes du développement ne sont pas facilement disponibles. Une autre option serait d'effectuer WISH sur les espèces de vertébrés différentes d'une demander aux élèves de comparer les profils d'expression des mêmes gènes dans des organismes différents (Pizard et al, 2004;. Aramaki et al, 2007;. Organismes modèles émergents, 2008; organismes modèles émergents, 2010).

L'objectif primordial de l'aide SOUHAITEZ dans un cours de biologie des vertébrés comparatif était de montrer aux élèves comment techniques de biologie moléculaire sont utilisées pour étudier le développement anatomique. Il a également donné l'occasion aux élèves de réfléchir sur la manière dont l'expression du gène altéré peut conduire non seulement à des malformations du développement, mais aussi à des changements évolutifs. Formalisé comme la biologie du développement évolutionnaire (souvent dénommé «évo-dévo»), ce domaine en plein essor de l'étude vise à relier le génotype et le phénotype par le développement, et d'élucider les bases mécanistiques potentiels du changement évolutif. Avec la montée de ce domaine, plus écologistes, des biologistes et des physiologistes organismiques, ont recours à des techniques moléculaires dans leurs recherches. Noussoutiennent que l'utilisation de WISH dans un cours de biologie des vertébrés comparative aidera à garder le programme à jour avec les avancées technologiques et conceptuels de la recherche et de faciliter un meilleur alignement horizontal du haut cours de biologie de niveau en combinant sous-champs biologiques. En outre, cette approche intégrative offrira aux étudiants la possibilité d'apprendre un assortiment de techniques de recherche biologiques dans un cours, conduisant à une formation plus diversifiée et la promotion de l'avenir de la recherche scientifique interdisciplinaire.

Materials

Material Name	Tipo	Company	Catalogue Number	Comment
5 Prime Fast Plasmid Mini Kit (100 preps)		Fisher	2300000
One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli with SOC Medium		Invitrogen	C404003
LB Agar		Fisher	BP1425-500
LB Broth		Fisher	BP1426-500
Ampicillin Sodium Salt		Fisher	BP1760-5
Isopropanol		Acros	42383-0010
Petri Dish 100 x 20 mm non treated		Laboratory Products Sales	430591
14 ml Culture Tube, Snap Top		Fisher	1495911B
Restriction Enzymes & Buffers & 10xBSA		New England Bio Labs	varies
Diethyl Pyrocarbonate (DEPC) 25 ml		Sigma	D5758-25mL
Sodium Acetate Trihydrate USP/FCC 500g		Fisher	s608500
Gal 200 proof Ethyl alcohol		Fisher	04-355-451
Tris-Acetate-EDTA (TAE) 50x Sol 1L		Fisher	bp13321
Agarose Low EEO 100 g		Fisher	BP160-100
Ethidium Bromide 10 ml		Sigma	45-E1510
Sucrose Gel Loading Dye 40% Sucrose		Fisher	BP655-1
1 kb Full Scale DNA Ladder		Fisher	BP2582200
DIG RNA Labeling Mix		Roche	11277073910
T3 RNA Polymerase		Roche	1031163
T7 RNA Polymerase		Roche	10881767001
SP6 RNA Polymerase		Roche	810274
Protector Rnase Inhibitor		Roche	3335399001
Dnase I, Rnase Free 10,000 units		Roche	4716728001
EDTA molecular biology reagent		Sigma	e5134-500G
Lithium Chloride 100 g		Fisher	L121100
Sodium Carbonate 1 kg		Fisher	BP357-1
Sodium Bicarbonate, 500 g		Fisher	BP328-500
Acetic Acid glacial ACS 500 ml		Fisher	a38500
Paraformaldehyde R 500 g		Fisher	o4042500
PBS Phosphate Buffer Saline 10X		Fisher	bp3991
Tween 20 500 ml		Fisher	bp337500
Methanol 5 L		Fisher	A4124
Proteinase K 50 mg		Fisher	bp170050
Formamide 1 L		Fisher	F841
20x SSC 1 L		Fisher	bp13251
Citric Acid Anhydrous ACS 500 g		Fisher	a940500
Ribonucleic acid transfer type V		Sigma	r7876-2.5KU
Heparin Sodium salt 50 mg		Fisher	bp252450
Maleic acid R 500 g		Fisher	o3417500
Sodium Chloride 500 g		Fisher	s271500
Sodium Hydroxide 500 g		Fisher	s318500
Blocking Reagent		Roche	11096176001
Lamb Serum 500 ml		Invitrogen	16070096
Anti DIG AP fragments		Roche	11093274910
2M Tris Solution 500 ml		Fisher	bp1759500
Magnesium Chloride 500 g		Fisher	m33500
BCIP 3 ml		Roche	11383221001
NBT 3 ml		Roche	11383213001
Glycerol 99% 2.5 L		Fisher	AC158920025
Plate 12 well PS ST w/Lid		VWR	62406-165
Tube 15 ml screw cap 50/rack 500/cs		Laboratory Products Sales	L262861
Tube 50 ml screw cap 25/rack 500/cs		Laboratory Products Sales	L262890
1.6 ml microfuge tube		Laboratory Products Sales	L234401
2 Parafilm 2″ x 250 ft		Fisher	s37441
Transfer Pipet 7 ml		USA Scientific	1020-2520
.1-10 μl Pipet Tip, Bulk		USA Scientific	1111-3000
1-200 μl Pipet Tip, Bulk		USA Scientific	1111-0006
101-1000 μl Pipet Tip, Bulk		USA Scientific	1111-2021
Aluminum Foil		Grocery Store

• Autoclave
• Micro-centrifuge
• 37°C incubator (with shaker)
• 4°C micro-centrifuge
• Water bath
• Vortex
• Gel electrophoresis apparatus
• -20°C freezer
• -80°C freezer
• Rocker/shaker
• 4°C refrigerator
• Dissecting microscope (preferably with a teaching screen or camera)