Mit Whole Berg In situ Hybridisierung zu Molecular Biology und Organismal Link-

Summary

Whole mount<em> In situ</em> Hybridisierung (WISH) wurde in einer oberen Ebene Bachelor Vergleichende Wirbeltiere Biology natürlich zusätzlich zu Dissektionen Wirbeltiere eingesetzt. Dies gab den Studierenden die Möglichkeit zu Genexpressionsmuster sowie grobe Anatomie zu studieren und verbindet das Studium der molekularen und organismischen Biologie in einem Kurs.

Abstract

Whole mount in situ Hybridisierung (WISH) ist eine verbreitete Technik in molekularbiologischen Laboratorien verwendet werden, um die Genexpression durch die Lokalisierung von spezifischen mRNA-Transkripte innerhalb der gesamten Probe aufsetzen zu studieren. Diese Technik (in Anlehnung an Albertson und Yelick, 2005) wurde in einer oberen Ebene Bachelor Vergleichende Wirbeltiere Biology Laboratory Klassenzimmer an der Syracuse University verwendet. Die ersten zwei Drittel des Comparative Biology Vertebrate Praktikum gab Studenten die Möglichkeit, der Embryologie und der makroskopischen Anatomie von mehreren Organismen, die verschiedene chordate Taxa in erster Linie über traditionelle Sezieren und die Verwendung von Modellen zu studieren. Der letzte Teil des Kurses beteiligt einen innovativen Ansatz zur Lehre Anatomie durch Beobachtung der Entwicklung von Wirbeltieren beschäftigt molekulare Techniken, bei denen Wunsch auf Zebrafisch-Embryos durchgeführt wurde. Eine heterozygote Fibroblasten-Wachstumsfaktor 8 a (fgf8a) Mutantenlinie, ace, verwendet wurde. Aufgrund Mendelschen Vererbung, Kreuzungen ace produziert Wildtyp, heterozygot und homozygot ace/fgf8a Mutanten in einer 1:2:1-Verhältnis. RNA-Sonden mit bekannten Expressionsmuster in der Mittellinie und in der Entwicklung anatomischen Strukturen wie Herz, Somiten, tailbud, Myotom und Gehirn verwendet. WISH wurde mit Zebrafisch auf den 13 Somiten und prim-6 Stufen, mit Studenten der Durchführung der Farbreaktion in der Klasse. Die Studie des Zebrafisch-Embryos in verschiedenen Stadien der Entwicklung gab den Studierenden die Fähigkeit zu beobachten, wie diese anatomischen Strukturen über Ontogenese verändert. Darüber hinaus zeigten einige ace/fgf8a Mutanten unsachgemäße Herzen Looping und Mängel in Somiten und die Entwicklung des Gehirns. Die Schülerinnen und Schüler in diesem Labor beobachtet die normale Entwicklung der verschiedenen Organsysteme mit beiden äußeren Anatomie sowie Genexpressionsmuster. Darüber hinaus identifiziert und Embryonen Anzeige falsche anatomische Entwicklung und Genexpression (dh, putative Mutanten) beschrieben.

Für Lehrer an Institutionen, die nicht bereits über die erforderlichen Geräte oder wo die Mittel für Labor-und curriculare Innovation beschränkt sind, können die finanziellen Kosten für die Reagenzien und Geräte ein Faktor zu betrachten, da wird die Zeit und Mühe auf den Teil der benötigten Lehrer unabhängig von der Einstellung. Trotzdem behaupten wir, dass die Verwendung von WISH in dieser Art von Unterricht im Labor Einstellung kann ein wichtiges Bindeglied zwischen Entwicklungsgenetik und Anatomie bieten. Die Entwicklung schreitet voran und die Fähigkeit zur organismischen Entwicklung auf molekularer Ebene Studie wird einfacher, billiger und immer beliebter, viele Evolutionsbiologen, Ökologen und Physiologen Forschungsstrategien im Bereich der Molekularbiologie drehen. Mit WISH in eine vergleichende Wirbeltiere Biology Laboratory Klassenzimmer ist ein Beispiel dafür, wie Moleküle und Anatomie kann in einem einzigen Kurs zusammen. Dies gibt oberen Ebene College-Studenten die Möglichkeit, moderne biologische Forschung Techniken, was zu einer stärker diversifizierten Bildung und die Förderung der Zukunft interdisziplinäre wissenschaftliche Forschung der Praxis.

Protocol

1. Plasmid Transformation von Target-cDNA Teil I: Die Transformation von Plasmid (Zeitaufwand: 3 Stunden plus Inkubation über Nacht) Warm SOC Nährlösung in einem 42 ° C Wasserbad (500 ul pro Reaktion) Thaw kompetenten Zellen auf Eis Add 1 ul Plasmid auf 25 ul kompetenten Zellen Auf Eis für 20 Minuten Hitzeschock-Zellen in 42 ° C Wasserbad für 45 Sekunden Unmittelbar Ort Zellen auf Eis für 2 Minuten Add 500 ul von 42 ° C Nährbouillon in jedes Fläschchen von Zellen Schütteln bei 37 ° C für 2 Stunden bei 255 Umdrehungen pro Minute (rpm) Tafel 75 ul Transformation Mix auf Luria Bertani (LB) Agarplatten Die Platten bei 37 ° C über Nacht invertiert Teil II: E. coli Kultur (Zeitaufwand: 15 Minuten plus Inkubation über Nacht) Für jede Reaktion Aliquot 3 ml LB-Bouillon und 3 ul 50 mg / mL Ampicillin in einer Kultur Rohr Scrape 1 Bakterien Kolonie von der Agarplatte und fügen Sie jede Kultur Rohr Schütteln Sie Kulturröhrchen bei 37 ° C bei 255 rpm über Nacht Teil III: Plasmid Prep (Zeitaufwand: 1,5 Stunden) Isolieren von Übernacht-Kulturen mit dem 5 Prime FastPlasmid Mini Kit (Katalog Nr. 2300000) Plasmid Um zu überprüfen, auf die Anwesenheit von Plasmid vorbereitet, führen Sie die DNA aus dem Kit auf einem 1% Tris-Acetat-EDTA (TAE)-Gel mit Ethidiumbromid gefärbt eluiert 2. In Situ DIG-markierten RNA-Sonde Synthese Teil I: Linearisierung der Plasmid (Zeitaufwand: 2,5 Stunden) In einem 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen, kombinieren: Vorbereitet Plasmid 20 mL Restriction Enzyme * 2 mL Buffer ** 10 mL 10X Bovine Serum Albumin (BSA) 10 mL Diethylpyrocarbonat (DEPC) Wasser 58 mL 100 mL Bei 37 ° C für 2 Stunden * Variiert mit Plasmid ** Variiert mit dem Restriktionsenzym Teil II: Transkription (Zeitaufwand: 3 Stunden) In einem 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen, kombinieren: Linear Plasmid 4 mL 10X Transcription Buffer ** 4 mL Digoxigenin Label Mix 4 mL Polymerase * 2 mL RNase-Inhibitor 2 mL DEPC Wasser 24 mL 40 mL Bei 37 ° C für 1 Stunde Add 2 ul der Polymerase * Bei 37 ° C für 1 Stunde Add 2 &mgr; l DNase Bei 37 ° C für 20 Minuten * Variiert mit Plasmid ** Variiert mit Polymerase Teil III: Niederschlag (Zeitaufwand: 5 Minuten plus 2 Stunde Inkubation über Nacht, 1 Stunde, um Zentrifuge und resuspendieren) Add 4 ul 0,2 M EDTA Add 5 ul 4M Lithiumchlorid Fügen Sie 150 ul eiskaltem 100% Ethanol Inkubation bei -80 ° C für 2 Stunden bis über Nacht Zentrifuge bei 14.000 rpm für 30 Minuten bei 4 ° C, Dekantieren entfernt Überstand Dry Pellet für 7 Minuten In 20 ul DEPC-Wasser Re-suspend Bei 37 ° C für 5 Minuten Teil IV: Die Fraktionierung – Führen Sie nur, wenn Sonde größer ist als 0,6 kb (Zeitaufwand: variiert je nach Sonde Größe, in der Regel nicht mehr als 20 Minuten) In einem 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen, kombinieren: RNA-Sonde 20 mL DEPC Wasser 12 mL Natriumbikarbonat 4 mL Sodium Carbonate 4 mL 40 mL Inkubieren in einem 60 ° C Wasserbad. Basis der Inkubationszeit auf die Gleichung: Dauer (Min.) = (ab kb – gewünschte kb) / (.11 x beginnend kb x gewünschte kb) Durchschnittliche gewünschte Größe = 0,6 kb Teil V: Final Niederschlag (Zeitaufwand: 5 minnuten plus 2 Stunde Inkubation über Nacht, 1 Stunde, um Zentrifuge und wieder auszusetzen, 1 Stunde für die Gel-Elektrophorese) Zugabe von 40 ul DEPC-Wasser Add 8 &mgr; l Natriumacetat Add 1,04 ul Eisessig Add 240 &mgr; l eiskaltem 100% Ethanol Inkubation bei -80 ° C für 2 Stunden bis über Nacht Zentrifuge bei 14.000 rpm für 30 Minuten bei 4 ° C, Dekantieren entfernt Überstand Dry Pellet für 7 Minuten In 20 ul DEPC-Wasser Re-suspend Vortex mischen Um zu überprüfen, auf das Vorhandensein von Ribosonde, führen Sie den resuspendierten Lösung auf einem 1% TAE-Gel mit Ethidiumbromid angefärbt 3. Whole mount in situ Hybridisierung Teil I: Fixation des Embryos und Proteinase K Verdau (Zeitaufwand: Fix Nacht plus 4 Stunden am nächsten Tag für die Lagerung, 2,5 Stunden von der Lagerung bis Part II) Sammeln Sie inszeniert Zebrafischembryonen und fix in 4% Paraformaldehyd (PFA) über Nacht bei 4 ° C Wash festen Embryonen in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung mit 0,1% Tween-20 (PBST) 3 mal für jeweils 10 Minuten Um das Risiko der Embryonen in die experimentelle Reagenzien, manuell dechorionate Embryonen (falls erforderlich) mit spitzen Pinzette zu gewährleisten Entwässern Embryonen durch Waschen in einer abgestuften Reihe von 25% und 50% Methanol in PBST für jeweils eine Stunde zu waschen, dann in 100% Methanol bei -20 ° C Wenn Sie bereit sind zu verwenden, rehydrieren Embryonen in PBST durch Waschen in 50% (2 mal) und 25% (1 Mal) Methanol in PBST für jeweils 10 Minuten. Schließlich waschen 2 mal für jeweils 10 Minuten in 100% PBST. Der genaue Zeitablauf ist nicht für PBST / Methanol wäscht wichtig Bleach Embryonen in einer 10% igen Wasserstoffperoxid-Lösung in PBST, wenn nötig, dunkle Pigmente zu entfernen. Embryonen sollten in Wasserstoffperoxid-Lösung für 10-20 Minuten inkubieren, je nach Alter des Embryos, und die Kappe der Mikrozentrifugenröhrchen sollte offen bleiben, um zu verhindern den Aufbau von Luftdruck Digest Embryonen mit 50 mg / mL Proteinase K 1:5000 verdünnt in PBST für 3-15 Minuten, je nach dem Alter des Embryos Re-fix Embryonen in 4% PFA für 30 Minuten, und dann 3 x waschen in PBST für jeweils 5 Minuten Teil II: Die Hybridisierung der Ribosonden (Zeitaufwand: 3 Stunden plus Übernachtung für die Hybridisierung, 1,5 Stunden am nächsten Tag an Teil III) Prehybridize Embryonen mit Prähybridisierungslösung (PHS) in eine vorgewärmte 70 ° C Wasserbad für 2-3 Stunden Entfernen PHS, 0,5 mL Hybridisierungslösung und 1,5 ul zuvor synthetisierten Digoxigenin markierte Ribosonden, bei 70 ° C über Nacht inkubieren. Die Temperatur kann innerhalb von ein paar Grad in Abhängigkeit von der Ribosonde Ziel schwanken Am nächsten Tag waschen Embryonen bei 70 ° C in abgestuften Lösungen von 75%, 50% und 25% PHS in 2X Kochsalzlösung Natriumcitrat (SSC) für jeweils 10 Minuten, dann in 0,2 X SSC waschen und 30 Minuten bei 68 ° C Wash in Maleinsäure-Puffer (MAB) 2 mal für jeweils 10 Minuten bei Raumtemperatur Teil III: Anti-Digoxigenin (α-DIG) Antikörper Inkubation (Zeitaufwand: 3 Stunden plus Übernachtung zu blockieren, zu 2,5 Stunden am nächsten Tag zum Teil IV) -Embryonen zu einem 12-Well-Platte Pre-Block Embryonen in 1-2 ml Blocking-Lösung für mindestens 3 Stunden bei Raumtemperatur Gleichzeitig pre-Block der Antikörper hergestellt, indem ein zweiter Band der Blockierungslösung und Verdünnen der anti-Digoxigenin-Antikörper 1:2000 in dieser Lösung Entfernen Sie vor Block und fügen 1-2 ml pre-blocked α-DIG-Lösung über Nacht inkubieren bei 4 ° C Am nächsten Tag waschen Embryonen in MAB. Lassen Sie die Embryonen in MAB für 5 Minuten Uraufführung inkubieren, dann führen Puffer Änderungen und inkubieren für zwei 10 Minuten, eine 30 Minuten und einem 60 Minuten Intervall. Der genaue Zeitablauf ist nicht notwendig Wash Embryonen 3 mal für jeweils 5 Minuten in alkalische Phosphatase (AP)-Puffer Teil IV: Die Färbung und Endbearbeitung (Zeitaufwand: 1 Stunde oder über Nacht zur Färbung, je nach Ribosonde verwendet wird, kann 4 Stunden, um von Glycerin wäscht, 6-10 Stunden pro Waschglycerinphase, beginnend in Glycerin aufbewahrt werden) Fügen Sie 1-2 mL Färbelösung, die Embryonen, wickeln Sie die Platte in Folie, und überprüfen Färbung in regelmäßigen Abständen (ca. alle 20 Minuten) bis zur Färbung reicht Wash Embryonen mit PBST 2 Mal für jeweils 5 Minuten, um die Farbreaktion zu stoppen Entwässern Embryonen mit 10 Minuten wäscht in 25% (1 Mal) und 50% (2 mal) Methanol in PBST, dann in 100% Methanol, um die Hintergrundfärbung zu entfernen Lassen Embryonen in 100% Methanol für mindestens 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubieren Rehydrieren in PBST mit 10 Minuten wäscht in 50% (2 mal) und 25% (1 Mal) Methanol in PBST, dann in 100% waschen PBST 2 Mal Transfer gebeizt embryos um eine 80% ige Glycerin-Lösung in PBST mit einer abgestuften Reihe von Waschungen und lagern bei 4 ° C. Rezepte: LB-Agar-Platten-10 g LB-Agar + 250 ml destilliertem Wasser, Autoklaven, wenn kühl an add 250 ul Ampicillin, pour 15-20 ml warme Lösung in jede Petrischale, damit Agar zur Verfestigung LB-Medium-12.5 g LB Broth + 200 ml destilliertem Wasser, Autoklaven, erlauben, bevor Sie mit kaltem 1% TAE-Gel-0.4 g Agarose, 40 ml 1X TAE, 2 ul Ethidiumbromid; Last 7 ul Plasmid (Plasmid Transformation von Target cDNA) oder 3 ul Ribosonde und 4 ul DEPC Wasser (In-situ-DIG-markierten RNA-Sonde Synthesis) + 1 ul loading Farbstoff, 5 ul DNA-Leiter Prähybridisierungslösung-50% Formamid, 5x SSC, 9,2 mm Zitronensäure, 1% Tween-20 Hybridisierungslösung-Prähybridisierungslösung plus 500 ug / ml tRNA und 50 pg / mL Heparin MAB-100mm Maleinsäure, 150 mM NaCl, 0,2 M NaOH, 0,1% Tween-20, pH auf 7,5 Blocking Solution-3 Teile MAB, 1 Teil 10% Boehringer Blockierungsreagenz in MAB, 1 Teil Wärme Lamm Serum deaktiviert AP-Puffer-60mm Tris-HCl pH 9,5, 60 mM NaCl, 30 mM MgCl 2, 0,1% Tween-20 Färbelösung-5-Bromo-4-Chlor-3-Indolyl-Phosphat (BCIP) und Nitro-Tetrazolium (NBT) in AP-Puffer 4. Repräsentative Ergebnisse Wenn richtig ausgeführt, wird die Reaktion zwischen dem NBT, BCIP und alkalische Phosphatase bilden einen violetten Niederschlag, der auf der Zebrafisch-Embryos als violetter Fleck erscheinen soll. Ribosonden sollte vorher aus cDNA entsprechend dem Gen von Interesse synthetisiert werden. Daher kann gefolgert werden jeden Fleck sichtbar repräsentiert Bereichen der Zebrafisch, in denen das Gen von Interesse an diesem speziellen Entwicklungsphase wurde transkribiert werden. Fgf8a (Reifers et al, 1998;;. Abbildung 2); deltaC (Oates et al, 2005.) Für die Zwecke dieses Kurses wurden Ribosonden aus aldh1a2 (; Begemann et al, 2001;. Abbildung 1 zuvor raldh2) synthetisiert; MyoD1 (Weinberg et al, 1996.); shha (. Krauss et al, 1993), pax2a (Brand et al, 1996;. Abbildung 3) und myl7 (bisher cmlc2;. Yelon et al, 1999) cDNA. Die Färbung wurde in der Mittellinie und in anatomischen Strukturen einschließlich der Somiten, tailbud, Myotom, Gehirn und Herz zu erwarten. Ace/fgf8a Mutanten erwartet wurde, Mängel in viele dieser Strukturen haben. Die Färbung war einfach visualisiert mit Hilfe eines Standard-Binokular. Weitere Quellen enthalten weitere Informationen und Fehlersuche an WISH Techniken ähnlich denen hier beschriebene (Clark, 2003;. D'Costa et al, 2009; Schmoldt et al, 2009;. Schoenwolf, 2009). Abbildung 1. Ein Zebrafisch-Embryos 24 Stunden nach der Befruchtung, die mit Ribosonden spezifisch für aldh1a2 wurde hybridisiert. Die spezifische Markierung kann in den Augen, Hinterhirn, Brustflosse Knospe Primordien und Somiten zu sehen. Anterior ist oben, ist hinten auf den Boden. Abbildung 2. Ein Zebrafisch-Embryos in den 13 Somiten Stadium der Entwicklung, die mit einer Sonde spezifisch für fgf8a wurde hybridisiert. Die spezifische Markierung in der Telencephalon, dorsalen Zwischenhirn, Mittelhirn-Hinterhirn-Grenze, Somiten und tailbud gesehen. Ventral ist auf der linken Seite, ist dorsal nach rechts. Abbildung 3. A 22 Stunden nach der Befruchtung Zebrafischembryo, die mit einem Ribosonde spezifisch für pax2a, einem robusten Marker nützlich für die Visualisierung des Nervensystems wurde hybridisiert. Die spezifische Markierung kann in der Aderhaut Fissur, Mittelhirn-Hinterhirn-Grenze, Ohr-Vesikel und Rückenmarksneuronen gesehen werden. Dorsalansicht mit anterior der linken Seite.

Discussion

Wunsch wurde in einer vergleichenden Wirbeltiere Biology Laboratory natürlich verwendet werden, um die Schüler verstehen die Rolle der Genetik in der anatomischen Entwicklung durch die Visualisierung von bekannten Genexpressionsmuster. Für den ersten Teil des Kurses, durchgeführt Studenten Sezieren von Organismen aus verschiedenen chordate Taxa, so dass sie genügend Zeit, um zu studieren, zu verstehen, Vergleichen und Gegenüberstellen Wirbeltiere Anatomie.

Als Einführung in den zweiten Teil des Kurses wurden die Schüler eine formelle Vortrag beschreibt Zebrabärblingentwicklung und Anatomie gegeben. Die Methoden und die erwarteten Ergebnisse des Wunsches Experiment wurden ebenfalls diskutiert. Die Schüler wurden dann leben Zebrafisch auf Somitogenese und prim-6 Stufen der Entwicklung gegeben, und bei 2 und 5 Tage nach der Befruchtung (dpf) unter dem Binokular untersucht. Das war es, den Studierenden ein besseres Verständnis von dem, was Zebrafischembryonen aussehen und welche Arten von morphologischen Veränderungen, die über Ontogenese auftreten.

In den nächsten Labor Sitzung wurden die SchülerInnen Zebrafischembryonen in die WISH zuvor hatte ausgeführt gegeben. Sie wurden gebeten, zu studieren und beschreiben die Genexpressionsmuster für jedes Gen von Interesse (Ribosonde verwendet). Embryonen für WISH wurden aus Paarungen zwischen den Mitgliedern einer heterozygoten ace/fgf8a Linie abgeleitet. Basierend auf Mendelschen Vererbung, waren 25% der Embryonen aus der ace/fgf8a Paarungen erwartet, um homozygote Mutanten zu sein und Mängel in vielen der anatomischen Strukturen auf die in diesem Kurs konzentriert aufweisen. Basierend auf den veröffentlichten Berichten und unveröffentlichte Beobachtungen in der Albertson Labor wurden Defekte im Gehirn und unsachgemäße Herzen looping erwartet, aber auch Mängel in den Somiten (Brand et al, 1996;. Albertson und Yelick, 2005; persönliche Beobachtungen).

Die Schüler wurden gebeten, alle Proben, Wildtyp (heterozygote Tiere sind nicht von Wildtyp-Geschwister in frühen Stadien der Entwicklung) und homozygote Mutanten zu untersuchen, für jeden Genexpressionsmuster vorgestellt. Sie wurden dann gebeten, Laborberichte beschreiben ihre Ergebnisse zu schreiben, und auf der Grundlage ihrer Kenntnisse der Anatomie und Genetik, wie defekte Gen-Expression kann anatomische Fehlbildungen gefällt haben.

Die Schüler schienen diese Laborübung mit Spannung und Neugier zu erhalten. Die meisten hatten noch nie verwendet WISH vor und waren sehr in diesem Teil des Kurses interessiert. Die Schüler fanden die unterschiedlichen Muster der Genexpression in der Zebrafisch-Embryos faszinierend, visualisiert einige sogar beschrieb die Färbungsmuster indem man sie mit bekannten Designs und Symbole, wie ein Smiley-Gesicht. Die daraus resultierende Laborberichte zeigten die Schüler hatten ein allgemeines Verständnis für den Wunsch-Protokoll und die Expression von Genen in bestimmten anatomischen Strukturen. Die Studierenden wurden auch erforderlich, um die spezifischen Funktionen der Gene zu verstehen studierte mit WISH während des Labor (Stickney et al, 2000;. Huelsken et al, 2002;. Geetha-Loganathan et al, 2008a;.. Geetha-Loganathan et al, 2008b ). Es war offensichtlich, aber dass bestimmte Teilnehmer beschränkt Hintergrundwissen über die Signalwege und Gene von Interesse war. Weitere Informationen zu diesen Konzepten in dem Wunsch Einführungsvortrag kann eine willkommene Ergänzung für die Verwendung von WISH in Zukunft Comparative Biology Vertebrate Kurse.

Da das Protokoll dauert in der Regel vier aufeinander folgenden Tagen, je nach dem Zeitplan des Kurses können die Schüler nur in der Lage sein, einen Teil des Experiments in der Klasse und der Lehrer muss für den Rest abgeschlossen. In unserem Comparative Biology Wirbeltiere Klasse abgeschlossen Studenten die Färbung Reaktionen im Labor, während die Teaching Assistant durchgeführt alle vorangegangenen Schritte. Wenn es bevorzugt ist, den Schülern durchführen wollen in der Klasse haben, kann das Protokoll in Untereinheiten, die über mehrere Sitzungen Labor durchgeführt werden, können je nach den zeitlichen Rahmen für die Klasse geteilt werden. Wenn es nicht machbar ist für Studenten das gesamte Protokoll durchführen, um, wie es hier war aufgrund der Labor-Sitzung nur einmal in der Woche können die Schüler die Färbelösung zu Beginn der Klasse hinzu, und, je nach Ribosonde verwendet werden, haben die Färbung komplett innerhalb einer Stunde. Die Zeit, die für den Fleck zu entwickeln variiert stark mit jedem Ribosonde und eine Vielzahl von experimentellen Bedingungen und sollten vor der Klasse vorgegeben werden. Bemerkenswert ist, wenn die Schüler nur dann entwickeln Sie den Fleck in Labor, wird Trainer ist verantwortlich für alle vorhergehenden Schritte, die viel Zeit und Aufwand außerhalb des Klassenzimmers erfordert. Falls gewünscht, könnte eine kürzere Alternative zu wünschen Immunhistochemie mit Antikörper Etiketten Proteinlokalisierung visualisieren, aber in dieser Zeit, sind Zebrafisch-spezifische Antikörper für Entwicklungsbiologie Gene nicht ohne weiteres verfügbar. Eine weitere Möglichkeit wäre, WISH auf verschiedenen Wirbeltierarten durchführennd haben die Schüler vergleichen die Expressionsmuster der gleichen Gene in verschiedenen Organismen (Pizard et al, 2004;. Aramaki et al, 2007;. Schwellenländer Modellorganismen, 2008; Schwellenländer Modellorganismen, 2010).

Das übergeordnete Ziel der Verwendung von WISH in eine vergleichende Wirbeltiere Biology Kurses war es, die Studierenden, wie molekularbiologische Techniken verwendet, um anatomische Entwicklung Studie zu demonstrieren. Es bot auch Gelegenheit für Studenten, wie veränderte Genexpression kann nicht nur zu Missbildungen, sondern auch auf evolutionären Wandel führen zu spekulieren. Formalisiert als evolutionäre Entwicklungsbiologie (oft als "Evo-Devo" genannt), soll mit diesem schnell wachsenden Bereich der Studie zur Genotyp und Phänotyp durch die Entwicklung zu verknüpfen und potenzielle mechanistischen Grundlagen der evolutionären Wandel zu erläutern. Mit dem Aufstieg der auf diesem Gebiet sind mehr Ökologen, organismal Biologen und Physiologen Einsatz molekularbiologischer Techniken in ihre Forschung. Wir behaupten, dass die Verwendung von WISH in eine vergleichende Wirbeltiere Biology natürlich wird dazu beitragen, den Lehrplan halten, um mit der derzeitigen technologischen und konzeptionellen Fortschritte in der Forschung bisher und eine bessere horizontale Ausrichtung der oberen Ebene der Biologie Kurse durch die Kombination von biologischen Teilfelder zu erleichtern. Darüber hinaus wird diese integrative Ansatz bieten den Studierenden die Möglichkeit, eine Auswahl an biologischen Forschung Techniken in einem Kurs lernen, was zu einer stärker diversifizierten Bildung und die Förderung der Zukunft interdisziplinäre wissenschaftliche Forschung.

Materials

Material Name	Tipo	Company	Catalogue Number	Comment
5 Prime Fast Plasmid Mini Kit (100 preps)		Fisher	2300000
One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli with SOC Medium		Invitrogen	C404003
LB Agar		Fisher	BP1425-500
LB Broth		Fisher	BP1426-500
Ampicillin Sodium Salt		Fisher	BP1760-5
Isopropanol		Acros	42383-0010
Petri Dish 100 x 20 mm non treated		Laboratory Products Sales	430591
14 ml Culture Tube, Snap Top		Fisher	1495911B
Restriction Enzymes & Buffers & 10xBSA		New England Bio Labs	varies
Diethyl Pyrocarbonate (DEPC) 25 ml		Sigma	D5758-25mL
Sodium Acetate Trihydrate USP/FCC 500g		Fisher	s608500
Gal 200 proof Ethyl alcohol		Fisher	04-355-451
Tris-Acetate-EDTA (TAE) 50x Sol 1L		Fisher	bp13321
Agarose Low EEO 100 g		Fisher	BP160-100
Ethidium Bromide 10 ml		Sigma	45-E1510
Sucrose Gel Loading Dye 40% Sucrose		Fisher	BP655-1
1 kb Full Scale DNA Ladder		Fisher	BP2582200
DIG RNA Labeling Mix		Roche	11277073910
T3 RNA Polymerase		Roche	1031163
T7 RNA Polymerase		Roche	10881767001
SP6 RNA Polymerase		Roche	810274
Protector Rnase Inhibitor		Roche	3335399001
Dnase I, Rnase Free 10,000 units		Roche	4716728001
EDTA molecular biology reagent		Sigma	e5134-500G
Lithium Chloride 100 g		Fisher	L121100
Sodium Carbonate 1 kg		Fisher	BP357-1
Sodium Bicarbonate, 500 g		Fisher	BP328-500
Acetic Acid glacial ACS 500 ml		Fisher	a38500
Paraformaldehyde R 500 g		Fisher	o4042500
PBS Phosphate Buffer Saline 10X		Fisher	bp3991
Tween 20 500 ml		Fisher	bp337500
Methanol 5 L		Fisher	A4124
Proteinase K 50 mg		Fisher	bp170050
Formamide 1 L		Fisher	F841
20x SSC 1 L		Fisher	bp13251
Citric Acid Anhydrous ACS 500 g		Fisher	a940500
Ribonucleic acid transfer type V		Sigma	r7876-2.5KU
Heparin Sodium salt 50 mg		Fisher	bp252450
Maleic acid R 500 g		Fisher	o3417500
Sodium Chloride 500 g		Fisher	s271500
Sodium Hydroxide 500 g		Fisher	s318500
Blocking Reagent		Roche	11096176001
Lamb Serum 500 ml		Invitrogen	16070096
Anti DIG AP fragments		Roche	11093274910
2M Tris Solution 500 ml		Fisher	bp1759500
Magnesium Chloride 500 g		Fisher	m33500
BCIP 3 ml		Roche	11383221001
NBT 3 ml		Roche	11383213001
Glycerol 99% 2.5 L		Fisher	AC158920025
Plate 12 well PS ST w/Lid		VWR	62406-165
Tube 15 ml screw cap 50/rack 500/cs		Laboratory Products Sales	L262861
Tube 50 ml screw cap 25/rack 500/cs		Laboratory Products Sales	L262890
1.6 ml microfuge tube		Laboratory Products Sales	L234401
2 Parafilm 2″ x 250 ft		Fisher	s37441
Transfer Pipet 7 ml		USA Scientific	1020-2520
.1-10 μl Pipet Tip, Bulk		USA Scientific	1111-3000
1-200 μl Pipet Tip, Bulk		USA Scientific	1111-0006
101-1000 μl Pipet Tip, Bulk		USA Scientific	1111-2021
Aluminum Foil		Grocery Store

• Autoclave
• Micro-centrifuge
• 37°C incubator (with shaker)
• 4°C micro-centrifuge
• Water bath
• Vortex
• Gel electrophoresis apparatus
• -20°C freezer
• -80°C freezer
• Rocker/shaker
• 4°C refrigerator
• Dissecting microscope (preferably with a teaching screen or camera)