¿Cómo los nichos y las células madre se forman durante el desarrollo es una cuestión importante con implicaciones prácticas. En el<em> Drosophila</emOvario>, el germen de las células madre de línea y sus nichos somáticos se forman durante el desarrollo larvario. Este video muestra la forma de analizar, las manchas y montaje de las gónadas femeninas a partir de finales del tercer estadio (LL3)<em> Drosophila</em> Larvas.
Muchos órganos dependen de las células madre para su desarrollo durante la embriogénesis y para el mantenimiento o la reparación durante la vida adulta. La comprensión de cómo las células madre forman, y cómo interactúan con su medio ambiente es crucial para comprender el desarrollo, la homeostasis y las enfermedades. El ovario de la mosca de la fruta Drosophila melanogaster, ha servido como un influyente modelo para la interacción de las células germinales madre de línea (GSCS) con sus células de apoyo somáticas (nicho) 1, 2. La ubicación conocida del lugar y la GSCS, junto a la capacidad de manipularlos genéticamente, ha permitido a los investigadores para esclarecer una serie de interacciones entre las células madre y sus nichos 3-12.
A pesar de la gran cantidad de información sobre los mecanismos de control de mantenimiento de la SGC y la diferenciación, se sabe relativamente poco sobre cómo GSCS y sus nichos de forma somática durante el desarrollo. Alrededor de 18 nichos somáticas, cuyos componentes celulares son filamentos de terminales y las células de la tapa (Figura 1), se forman durante el tercer estadio larval 13-17. GSCS originan de las células germinales primordiales (PGC). PGCs proliferan en las primeras etapas larvales, pero tras la formación del nicho de un subgrupo de PGCs se GSCS 7, 16, 18, 19. En conjunto, las células somáticas de nicho y la GSCS hacer una unidad funcional que produce óvulos durante la vida del organismo.
Muchas preguntas sobre la formación de la unidad de GSC permanecen sin respuesta. Procesos tales como la coordinación entre las células precursoras de los nichos y los precursores de células madre, o la generación de la asimetría en PGCs a medida que se GSCS, mejor se pueden estudiar en la larva. Sin embargo, un estudio metódico de desarrollo del ovario larval es un reto físico. En primer lugar, los ovarios de las larvas son pequeñas. Incluso a finales de estadios larvarios son sólo 100μm de diámetro. Además, los ovarios son transparentes y están integrados en un cuerpo de grasa blanca. Aquí se describe un protocolo de paso a paso para el aislamiento de los ovarios de finales del tercer estadio (LL3) larvas de Drosophila, seguido de tinción con anticuerpos fluorescentes. Ofrecemos algunas soluciones técnicas a problemas como la localización de los ovarios, las manchas y el lavado de tejidos que no se hunden, y asegurarse de que los anticuerpos de penetrar en el tejido. Este protocolo se puede aplicar a las primeras etapas de larvas y larvas en los testículos también.
Este vídeo demuestra un aislamiento y el protocolo de tinción de los ovarios a finales del tercer estadio larval. Para llevar a cabo este protocolo de forma rutinaria y segura, se debe prestar atención a los siguientes puntos:
The authors have nothing to disclose.
IM es compatible con el Marie Curie reintegración subvención. Este trabajo fue apoyado por el Fondo de Ciencias de Israel no Grant. 1146-1108, por el Helen y Martin Kimmel Instituto para la Investigación de Células Madre en el Instituto Weizmann de la Ciencia y la Fundación Caritativa Leir.
Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
NaCl | J.T.Baker | |||
Kcl | Merck | |||
CaCl2 | Sigma-Aldrich | |||
MgCl2 | Merck | |||
Sucrose | J.T.Baker | |||
Hepes | Sigma-Aldrich | |||
PBS | Sigma-Aldrich | |||
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | |||
Albumin Bovine Fraction V | MP Biomedicals | 160069 | ||
Dumont biology tweezers 5 dumstar polished | FST Fine Science Tools | 11295-10 | ||
Nickel plated pin holder | FST Fine Science Tools | 26018-17 | ||
s.s minutien pins 0.1mm diam, 10mm long | FST Fine Science Tools | 26002-10 | ||
9 well plates 85X100 mm, 22mm o.d.x7mm deep | CORNING | 7220-85 | ||
Stereo Microscope MZ 16.5 with a standard transmitted light base TL ST | Leica | |||
6 well plates | Costar | 3516 | ||
Slides | Menzel Glaser GmbH | 798 | ||
Cover slips | Corning | 2940-223 | ||
Mounting media | Vectashield | H-1200 | ||
Cell strainer | Falcon | FAL352350 | ||
1B1 antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | |||
Anti-Traffic Jam | Laboratory of Dr. Dorothea Godt | |||
Anti-Vasa | Laboratory of Dr. Ruth Lehmann | |||
Anti β-Galactosidase | Cappel | |||
Secondary Antibodies | Jackson ImmunoResearch |