विस्तार, शोधन, और मानव परिधीय रक्त एन.के. कोशिकाओं के कार्यात्मक मूल्यांकन

Summary

यहाँ हम विस्तार करने के लिए कुशलतापूर्वक और मानव एन.के. कोशिकाओं की बड़ी संख्या शुद्ध और उनके कार्य का आकलन विधि का वर्णन.

Abstract

Natural killer (NK) cells play an important role in immune surveillance against a variety of infectious microorganisms and tumors. Limited availability of NK cells and ability to expand in vitro has restricted development of NK cell immunotherapy. Here we describe a method to efficiently expand vast quantities of functional NK cells ex vivo using K562 cells expressing membrane-bound IL21, as an artificial antigen-presenting cell (aAPC).

NK cell adoptive therapies to date have utilized a cell product obtained by steady-state leukapheresis of the donor followed by depletion of T cells or positive selection of NK cells. The product is usually activated in IL-2 overnight and then administered the following day ¹. Because of the low frequency of NK cells in peripheral blood, relatively small numbers of NK cells have been delivered in clinical trials.

The inability to propagate NK cells in vitro has been the limiting factor for generating sufficient cell numbers for optimal clinical outcome. Some expansion of NK cells (5-10 fold over 1-2 weeks) has be achieved through high-dose IL-2 alone ². Activation of autologous T cells can mediate NK cell expansion, presumably also through release of local cytokine ³. Support with mesenchymal stroma or artificial antigen presenting cells (aAPCs) can support the expansion of NK cells from both peripheral blood and cord blood ⁴. Combined NKp46 and CD2 activation by antibody-coated beads is currently marketed for NK cell expansion (Miltenyi Biotec, Auburn CA), resulting in approximately 100-fold expansion in 21 days.

Clinical trials using aAPC-expanded or -activated NK cells are underway, one using leukemic cell line CTV-1 to prime and activate NK cells⁵ without significant expansion. A second trial utilizes EBV-LCL for NK cell expansion, achieving a mean 490-fold expansion in 21 days⁶. The third utilizes a K562-based aAPC transduced with 4-1BBL (CD137L) and membrane-bound IL-15 (mIL-15)⁷, which achieved a mean NK expansion 277-fold in 21 days. Although, the NK cells expanded using K562-41BBL-mIL15 aAPC are highly cytotoxic in vitro and in vivo compared to unexpanded NK cells, and participate in ADCC, their proliferation is limited by senescence attributed to telomere shortening⁸. More recently a 350-fold expansion of NK cells was reported using K562 expressing MICA, 4-1BBL and IL15⁹.

Our method of NK cell expansion described herein produces rapid proliferation of NK cells without senescence achieving a median 21,000-fold expansion in 21 days.

Protocol

1. PBMCs के Buffy कोट से अलगाव परिधीय रक्त कोशिकाओं mononuclear (PBMC) स्वस्थ दाता buffy कोट leukapheresis द्वारा प्राप्त नमूनों से Ficoll Paque पर प्रसन्नचित्त घनत्व centrifugation द्वारा प्राप्त कर रहे हैं. Ficoll – Paque centrifugation प्रति निर्माता मामूली संशोधनों के साथ प्रोटोकॉल के रूप में किया जाता है. एक सामान्य दाता पीबीएस 140 एमएल (ठेठ buffy कोट की मात्रा 40-70 एमएल) के अंतिम मात्रा में रक्त बैंक buffy कोट जोड़ें. परत Ficoll Paque (4 ट्यूब) के 15 एमएल पर 35 एमएल buffy कोट नमूना के. ब्रेक के बिना 20 मिनट के लिए 400g पर अपकेंद्रित्र. Ficoll – Paque से PBMCs पुनर्प्राप्त: प्लाज्मा इंटरफ़ेस, Ficoll – Paque के तल पर लाल रक्त कोशिकाओं को अलग नहीं. PBMCs पीबीएस के साथ तीन बार धो, 400g में 10 मिनट के लिए हर समय centrifuging. PBMCs एन.के. सेल के विस्तार के इस स्तर पर या एन.के. कोशिकाओं के लिए सीधे इस्तेमाल किया जा सकता है RosetteSep से अलग किया जा सकता है है (धारा 4) शेष PBMCs FBS में जमे हुए किया जा सकता है तरल नाइट्रोजन में 10% DMSO युक्त. Ficoll Aspirate और 5 कदम से दो 50 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब में लाल रक्त कोशिकाओं को इकट्ठा करने के लिए, पीबीएस (50 एमएल निशान को जोड़ा) के साथ तीन बार धोकर, हर बार aspirate सतह पर तैरनेवाला उड़े granulocytes आरबीसी परत के शीर्ष को हटाने के लिए. लाल रक्त कोशिकाओं RosetteSep एन.के. कोशिकाओं की  शुद्धि (4 खंड देखें) के लिए तुरंत इस्तेमाल किया जा सकता है या 4 Alsever समाधान के बराबर मात्रा में संग्रहीत डिग्री सेल्सियस बाद में उपयोग के लिए (लाल रक्त कोशिकाओं की दुकान 4 सप्ताह की एक अधिकतम के लिए किया जा सकता है ). 2. एन.के. सेल विस्तार एन.के. सेल विस्तार PBMCs का उपयोग कर या एन.के. कोशिकाओं को शुद्ध शुरू किया जा सकता है. विस्तार के लिए इस्तेमाल किया PBMCs की राशि एन.के. एक तीन सप्ताह के विस्तार के अंत में वांछित कोशिकाओं की राशि के आधार पर अलग किया जा सकता है, प्रतिनिधि विवरण के लिए परिणाम अनुभाग देखें. (नोट 1 देखें) 1 उत्तेजना 0 दिन प्रत्येक 5×10 6 PBMCs करने के लिए विस्तारित किया जा के लिए भरोसा है, और 6 10×10 K562 Cl9 mIL21 चमकाना 100 Gy पर एक गामा irradiator का उपयोग. डाक विकिरण, पीबीएस और एन.के. सेल विस्तार मीडिया (NKEM) में resuspend के साथ कोशिकाओं को धो लो. बीज 5×10 6 10×10 विकिरणित K562 Cl9 NKEM के 40 एमएल में (1:2 अनुपात) और T75 फ्लास्क में mIL21 ईमानदार यह 37 पर एक मशीन में जगह डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2. साथ 6 PBMCs दिन 3 और 5 Centrifugation द्वारा कोशिकाओं 400g पर 5 मिनट के लिए पुनर्प्राप्त और ताजा NKEM के साथ मीडिया के आधे की जगह (पूरी मीडिया की मात्रा के लिए ताजा IL2 जोड़ने) और संस्कृति जारी है. 2 उत्तेजना 7 दिन एक सप्ताह के अंत में संस्कृति में कोशिकाओं की संख्या की गणना. अलग 5×10 प्रवाह cytometry द्वारा 5 phenotyping के लिए कोशिकाओं (नोट 2 देखें) सेट प्रत्येक 5×10 6 restimulated हो कोशिकाओं के लिए भरोसा है, और 6 5×10 K562 Cl9 mIL21 चमकाना 100 Gy पर एक गामा irradiator का उपयोग. 2.5×10 5 कुल कोशिकाओं / एमएल NKEM में एक K562 विकिरणित Cl9 (1:1 अनुपात) mIL21 resuspend और के बराबर संख्या जोड़ें (देखें नोट 3). T75 बोतल में बीज कोशिकाओं (फ्लास्क प्रति 50 एमएल अधिकतम). 10 दिन और 12 कक्षों की संख्या की गणना. ताजा सेल नंबर के आधार पर NKEM के साथ पूरे मीडिया बदलें (देखें नोट 3). 14 दिन विस्तार के दो सप्ताह के अंत में संस्कृति में कोशिकाओं की संख्या गिनती. अलग 5×10 प्रवाह cytometry द्वारा 5 phenotyping के लिए कोशिकाओं (नोट 2 देखें) सेट यदि विस्तार PBMCs से शुरू किया गया था एन.के. कोशिकाओं RosetteSep शुद्धि प्रोटोकॉल (धारा चतुर्थ करने के लिए उल्लेख) का उपयोग कर विस्तार के इस स्तर पर शुद्ध किया जा सकता है है. यदि विस्तार एन.के. कोशिकाओं 3 उत्तेजना को आगे बढ़ना शुद्ध से शुरू किया गया था. बाद शुद्धि तरफ प्रवाह cytometry द्वारा phenotyping एन.के. कोशिकाओं (के रूप में चरण 8 में) की शुद्धता को सत्यापित करने के लिए करने के लिए 5×10 5 कोशिकाओं सेट. 3 उत्तेजना शुद्ध एन.के. कोशिकाओं के सभी (नोट 4 देखें) का उपयोग कर के साथ आगे बढ़ें. 3 उत्तेजना Resuspend एन.के. कोशिकाओं K562 विकिरणित Cl9 (1:1 अनुपात) के सेल नंबर के आधार पर NKEM में mIL21 (देखें नोट 3) के साथ. 17 दिन और 19 कक्षों की संख्या की गणना. ताजा सेल नंबर के आधार पर NKEM के साथ मीडिया बदलें (देखें नोट 3). 21 दिन विस्तार के तीन सप्ताह के अंत में संस्कृति में कोशिकाओं की संख्या गिनती. 1×10 प्रवाह cytometry विश्लेषण के लिए पूर्ण एन.के. सेल phenotyping एंटीबॉडी पैनल के लिए 6 कोशिकाओं (देखें तालिका 1) पुनर्प्राप्त. FBS में भविष्य में उपयोग के लिए 5×10 7 शीशी प्रति कोशिकाओं की एक अधिकतम घनत्व 10% DMSO युक्त कोशिकाओं रुक. 3. एन.के. सेल cytotoxicity परख NKEM में एन.के. कोशिकाओं और बीज की एक शीशी, एक पे करने के लिए पहले दिन पहले गला लेंcytotoxicity परख rforming करने के लिए वसूली की अनुमति. (नोट 5 को देखें) प्रत्येक एन.के. सेल cytotoxicity एक लक्ष्य कक्ष लाइन, 6×10 5 एन.के. कोशिकाओं और 3×10 5 लक्ष्य कोशिकाओं का उपयोग परख के लिए आवश्यक हैं. सीएएम मीडिया गिराए (1 शेयर एमएल / DMSO में मिलीग्राम) NKEM में Calcein-AM (नोट 6 को देखें) द्वारा तैयार. सीएएम मीडिया के 1 एमएल में 10 6 लक्ष्य कोशिकाओं Resuspend (नोट 7 देखें). 37 ° C में 1 ज के लिए कभी कभी झटकों के साथ, सेते हैं. Resuspend 1×10 6 कोशिकाओं / एमएल पर एन.के. कोशिकाओं और एक U – नीचे के तीन कुओं में से प्रत्येक के लिए एन.के. सेल निलंबन के 200uL जोड़ने 96 अच्छी तरह से थाली to10 इसी: 1 ई: टी अनुपात चित्र 1 में दिखाया गया है. (नोट 8 देखें) "अधिकतम" के लिए छोड़कर शेष सभी कुओं को पूरा मीडिया के 100uL जोड़ें. "अधिकतम" 100 100uL ट्राइटन 2% की एक्स. 5 बाद ई के लिए एन.के. कोशिकाओं के धारावाहिक dilutions प्रदर्शन: कक्षों की हर बार 100uL स्थानांतरित द्वारा टी अनुपात, मिश्रण अच्छी तरह से. पिछले कुओं (0.3125:1 के टी अनुपात ई) से 100uL त्यागें. Calcein लोडिंग के 1 घंटे के बाद, NKEM में लक्ष्य कोशिकाओं में दो बार धोने, 1200 rpm पर 5 मिनट के लिए centrifuging. (नोट: 9 देखें) 1×10 5 कोशिकाओं / एमएल पर लक्षित कोशिकाओं और resuspend पुन गिनती. प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए लक्ष्य कोशिकाओं के 100 μL जोड़ें (1×10 4 अच्छी तरह /). 100g पर 1 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र सेल संपर्क आरंभ. 37 में सेते डिग्री सेल्सियस और 5% 4 घंटे के लिए सीओ 2. संस्कृति एक 100 μL pipetter साथ pipetting क्रम में समान रूप से जारी calcein को निलंबित करके धीरे मिश्रण करने के लिए, नीचे 100g पर गोली कोशिकाओं के लिए 5 मिनट के लिए थाली और स्पिन एक नई बुलबुले से बचने के ख्याल रख रही थाली की सतह पर तैरनेवाला 100 μL हस्तांतरण. किसी भी बुलबुले पॉप कि ठीक सुई का उपयोग हो सकता है फार्म. प्लेट का उपयोग कर एक फ्लोरोसेंट प्लेट पाठक (उत्तेजना फिल्टर 485 एनएम, उत्सर्जन फिल्टर 530 एनएम) पढ़ें. नीचे को पढें की सिफारिश की है. X 100. सूत्र [(परीक्षण जारी सहज रिलीज) / (सहज रिलीज अधिकतम रिलीज)] के अनुसार प्रतिशत विशिष्ट lysis की गणना 4. एन.के. RosetteSep द्वारा सेल शोधन PBMCs या विस्तार कोशिकाओं की है कि एक 50 एमएल ट्यूब (PBMC: 100:1 आरबीसी) में लाल रक्त कोशिकाओं की 100 गुना अधिक ले लो. यदि ताजा लाल रक्त कोशिकाओं का उपयोग कर अगले कदम के लिए सीधे आगे बढ़ना या यदि लाल रक्त कोशिकाओं Alsever समाधान है में संग्रहित किया गया, लाल रक्त कोशिकाओं की संख्या गिनने और उचित धोने (100 गुना अधिक) 2% FBS के साथ तीन बार पूरक पीबीएस के साथ लाल रक्त कोशिकाओं की राशि, 1200 rpm पर centrifuging 10 मिनट प्रत्येक समय के लिए. 1.7 कदम या पीबीएस में 2.10 कदम से विस्तार कोशिकाओं से PBMCs के साथ लाल रक्त कोशिकाओं का मिश्रण + 2% FBS 7 5×10 PBMCs या विस्तार कोशिकाओं के प्रति 1 एमएल के अंतिम मात्रा करने के लिए . RosetteSep के  मानव 1×10 6 प्रति PBMCs या विस्तार कोशिकाओं के एन.के. सेल संवर्धन कॉकटेल 1μL जोड़ें. अच्छी तरह मिक्स और कोमल प्रत्येक 5 मिनट मिश्रण के साथ 20 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं. पीबीएस + 2% FBS मिश्रण के बराबर मात्रा धीरे और Ficoll – Paque के शीर्ष पर परत जोड़ें. Ficoll Paque PBMC अलगाव के लिए वर्णित centrifugation (मैं धारा) के कदम दोहराएँ. शुद्धि के बाद बरामद एन.के. कोशिकाओं की गिनती और एक तरफ एन.के. सेल शुद्धता (कदम 8) के लिए प्रवाह cytometry द्वारा phenotpying 5×105 कोशिकाओं के लिए सेट. 5. नोट्स 1. एन.के. कोशिकाओं PBMCs से सीधे विस्तार कर सकते हैं, या RosetteSep  शुद्ध एन.के. कोशिकाओं से नोट. हम इसी तरह की विस्तार क्षमता का उल्लेख है, लेकिन कुछ दाताओं बहुत कम एन.के. सेल संख्या RosetteSep द्वारा कठिनाई सफ़ाई में जिसके परिणामस्वरूप विस्तार करने के लिए पहले हो सकता है. नोट 2. हम नियमित रूप से विस्तार के दौरान phenotyping के लिए CD56-FITC, CD16 पीई, और CD3-पीई Cy5, उपयोग करने के लिए उन जो CD3-नकारात्मक और CD16 या CD56 सकारात्मक रहे हैं के रूप में एन.के. कोशिकाओं की गणना. नोट 3 प्रत्येक मीडिया परिवर्तन या उत्तेजना, 2.5 x 10 5 एमएल / resuspend कोशिकाओं में विस्तार के शिखर चरणों पर या प्रति के तहत 2 लाख एमएल PBMC / एन.के. सेल नंबर रखने के लिए. यह पोषक तत्वों की कमी को रोकने के लिए और अधिक से अधिक विस्तार और अस्तित्व को प्राप्त मदद करेंगे. नोट 4. एन.के. विस्तार दर दाता 1 stimulations या कोशिकाओं है जमे हुए कर सकते हैं सकता है के भाग 2 के अंत पर निर्भर है और है और भाग प्रयोगात्मक जरूरत के आधार पर आगे विस्तार. हम विस्तार के लिए एक बाद में समय पर जमे हुए कोशिकाओं का उपयोग करने में अच्छी सफलता मिली है. 5 नोट आदेश में त्रुटि के लिए कमरे की अनुमति के लिए हम 7×10 5 एन.के. NKEM और 4×10 5 Calcein AM दाग लक्ष्य cytotoxicity परख की स्थापना के लिए NKEM के 4 एमएल में resuspended कोशिकाओं के 700 ULS में resuspended कोशिकाओं की एक न्यूनतम का उपयोग करने की सलाह देते हैं. यदि लक्ष्य कोशिकाओं कोशिकाओं की उच्च मात्रा (6 एमएल में 5 6×10) इस्तेमाल किया जा रहा है मीडिया बेसिन के आकार के आधार पर आवश्यक हो सकता है बोने के लिए multichannel विंदुक का उपयोग. इसके अलावा सिफारिश एन.के. सेल नंबर ई के लिए विशेष रूप से कर रहे हैं: टी अनुपात प्रोटोकॉल में दिखाने के लिए, उच्च ई का उपयोग करने के लिए: टी अनुपात में वृद्धिएमएल प्रति एन.के. सेल संख्या तदनुसार (eg. एक 40:1 ई के लिए: टी अनुपात उपयोग 4×10 6 कोशिकाओं / एमएल) 6 नोट हम पसंद का लक्ष्य सेल लाइन के लिए एक प्रारंभिक अनुमापन Calcein AM लोड हो रहा है प्रदर्शन करने की सलाह देते हैं, 1:500, 1:400 के निम्नलिखित dilutions का उपयोग.. 1:200, 1:300, और 1:100 अधिकतम और सहज रिहाई के बीच इष्टतम अंतर को प्राप्त है. 7 नोट जब लक्ष्य के रूप में एक पक्षपाती सेल लाइन का उपयोग कर, पहली बार एकल कक्ष निलंबन तैयार गैर enzymatic सेल हदबंदी बफर का उपयोग. यदि ADCC प्रदर्शन, सीएएम मीडिया में लक्षित कोशिकाओं का एक डुप्लिकेट ट्यूब तैयार करते हैं. 8 नोट यदि ADCC प्रदर्शन, 3 10:01 ई करने के लिए इसी कुओं ही एन.के. कोशिकाओं को जोड़ने के लिए टी ADCC . अतिरिक्त दाताओं के लिए दोहराएँ. अतिरिक्त लक्ष्य कोशिकाओं के लिए दोहराएँ. 9 नोट यदि एक ADCC प्रयोग प्रदर्शन, calcein लोडिंग के 45 मिनट के बाद, लक्ष्य कोशिकाओं के खिलाफ ADCC उत्प्रेरण के लिए विशिष्ट एंटीबॉडी के 10ug जोड़ें. 15 मिनट के बाद, पूरा माध्यम लक्ष्य कोशिकाओं में दो बार धोने, 1200 rpm पर 5 मिनट के लिए centrifuging. 1×10 5 कोशिकाओं / एमएल Resuspend कोशिकाओं और प्रोटोकॉल में अगले कदम के साथ आगे बढ़ना. 6. प्रतिनिधि परिणामों चित्रा 2. जब विस्तार के रूप में योजना के अनुसार किया जाता है ऊपर वर्णित है, शुरू सामग्री, ठेठ एन.के. सेल पैदावार से 1×10 9 10 10 कोशिकाओं (दाता निर्भर परिवर्तनशीलता) के लिए सीमा के रूप में 5×106 PBMCs का उपयोग. आंकड़ा एन.के. सेल गुना विस्तार से पता चलता है (n = 19) एन.के. मूल उत्पाद में मौजूद कोशिकाओं को (औसत + / – चतुर्थक) तुलना में. चित्रा 3. विस्तारित एन.के. कोशिकाओं विभिन्न एन.के. सेल रिसेप्टर्स कि कुछ अपवादों को छोड़कर (CD11b, CD160 और CD244) के साथ unexpanded प्राथमिक एन.के. कोशिकाओं के लिए तुलना कर रहे हैं व्यक्त . चित्रा 4 Buffy कोट से PBMCs वसूली निर्भर दाता है और 300×10 6 से 6 800×10 रेंज कर सकते हैं. PBMCs के 18% – एन.के. कोशिकाओं 2% शामिल हो सकता है. विस्तार कोशिकाओं के RosetteSep शुद्धि के लिए, दिन पर शुद्ध एन.के. 40-70% से 14 पर्वतमाला कोशिकाओं की वसूली. विस्तार और शुद्धि की सिफारिश प्रोटोकॉल का अनुसरण करके, 99% की एन.के. सेल शुद्धता की उम्मीद की जा सकती है. चित्रा 5. विस्तारित एन.के. कोशिकाओं neuroblastoma, एएमएल, ऑस्टियो सार्कोमा और मेलेनोमा (प्रतिनिधि एएमएल हत्या प्रतिशत विशिष्ट lysis के रूप में दिखाया) सहित ट्यूमर सेल लाइनों की एक श्रृंखला के खिलाफ cytotoxicity का प्रदर्शन किया है .

Materials

NK Cell Expansion and Activation Media (NKEM)

• 90% RPMI 1640 (Cellgro)
• 10% Fetal Bovine Serum (Gibco)
• 1x Penicillin / Streptomycin (Cellgro)
• 1x L-Glutamine (Gibco)
  • Filter Sterilize media before use.
• 50 U/ mL IL2 (Proleukin, Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc)
  • – Diluted from a 200 IU/μl stock. Add IL2 to desired amount of media just before use each time.

PBMC and NK Cell Isolation

• Ficoll-Paque (GE Healthcare)
• Alsever’s solution (Sigma)
• RosetteSep Human NK Cell Enrichment Cocktail (Stemcell Technologies)

NK Cell Cytotoxicity Assay

• Calcein-AM (Invitrogen)
  • Stock solution is at 1mg/ mL, store frozen in 50 μL aliquots. Dissolve in NKEM media to achieve desired dilution for cell staining.

Antibodies

The list of antibodies used for NK cell phenotyping are listed in table below;

	Antibody	Volume per Test	Company	Catalog number
Tube 1	Isotype FITC Isotype FITC Isotype FITC Isotype FITC FACS Buffer Total Volume	5 5 5 5 80 100	BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen	555748 555749 557224 340442
Tube 2	CD56 FITC NKp30 PE NKp44 PE NKp46 PE CD3 PE-Cy5 CD16 Alexa 647 FACS Buffer Total Volume	5 5 5 5 5 5 70 100	BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen	340410 558407 558563 557991 555341 557710
Tube 3	CD56 FITC KIR2DL1 PE KIR2DL2/3 PE KIR3DL1 PE CD3 PE-Cy5 NKG2D APC FACS Buffer Total Volume	5 5 5 5 5 5 70 100	BD Pharmingen R&D Systems Miltenyi Biotec R&D Systems BD Pharmingen BD Pharmingen	340410 FAB1844P 130-092-618 FAB12251P 555341 558071
Tube 4	CD56 FITC CD11b PE CD3 PE-Cy5 CD27 APC FACS Buffer Total Volume	5 5 5 5 80 100	BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen	340410 555388 555341 558664
Tube 5	CD56 FITC CD266 (DNAM-1) PE CD3 PE-Cy5 CD160 Alexa647 FACS Buffer Total Volume	5 5 5 5 80 100	BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen eBiosciences	340410 559789 555341 51-1609-42
Tube 6	CD56 FITC CD244 (2B4) PE CD3 PE-Cy5 CD197 (CCR7) APC FACS Buffer Total Volume	5 5 5 5 80 100	BD Pharmingen BD Pharmingen BD Pharmingen eBiosciences	340410 550816 555341 17-1979-42