1. Isolering av PBMC från Buffy Coat Perifera mononukleära blodceller (PBMC) erhålls genom stigande densitet centrifugering på Ficoll-Paque från friska givare lättcellsskikt prover fram genom leukaferes. Den Ficoll-Paque centrifugering sker enligt tillverkarens protokoll med smärre modifieringar. Lägg PBS en normal givare blod-bank buffycoat till en slutlig volym på 140 ml (typiskt buffycoat volymen 40-70 ml). Layer 35 ml buffy coat prov på 15 ml Ficoll-Paque (4 rör). Centrifugera vid 400g i 20 minuter utan broms. Återvinn PBMC från Ficoll-Paque: plasma gränssnitt, Kasta inte bort det röda blodkropparna i botten av Ficoll-Paque. Tvätta PBMC tre gånger med PBS, centrifugera varje gång vid 400g i 10 minuter. PBMC kan användas direkt för NK cell expansionen i detta skede eller NK-celler kan isoleras genom RosetteSep (avsnitt 4) Resterande PBMC kan frysas i FBS som innehåller 10% DMSO i flytande kväve. Aspirera Ficoll och samla in röda blodkropparna från steg 5 i två 50 ml centrifugrör, tvätta tre gånger med PBS (tillsätts 50 ml-markeringen), varje gång aspirera supernatanten skumma toppen av RBC lager att ta bort granulocyter. De röda blodkropparna kan användas omedelbart för RosetteSep rening av NK-celler (se avsnitt 4) eller lagras i lika stor volym av Alsever lösning vid 4 ° C för senare användning (De röda blodkropparna kan lagras i högst 4 veckor). 2. NK cell Expansion NK cellen utbyggnaden kan påbörjas med PBMC eller renat NK-celler. Mängden PBMC användas för expansion kan varieras baserat på mängden av NK-celler önskas i slutet av en tre veckors expansion, se representativa resultat för mer information. (Se not 1) STIMULERING 1 Dag 0 För varje 5×10 6 PBMC byggas ut, räkna och bestråla 10×10 6 K562 CL9 mIL21 med hjälp av en gamma irradiator vid 100 Gy. Inlägg bestrålning, tvätta cellerna med PBS och återsuspendera i NK-celler expansionen media (NKEM). Seed 5×10 6 PBMC med 10×10 6 bestrålade K562 CL9 mIL21 (1:2 förhållande) i 40 ml NKEM i en T75 kolv och placera den upprätt i en inkubator vid 37 ° C och 5% CO 2. Dagar 3 och 5 Recover cellerna genom centrifugering vid 400g i 5 min och ersätta hälften av media med färska NKEM (lägga till nytt IL2 för hela media volym) och fortsätt kultur. STIMULERING 2 Dag 7 Räkna antalet celler i kulturen i slutet av en vecka. Ställ åt sidan 5×10 5 celler för fenotypning med flödescytometri (se not 2) För varje 5×10 6 celler ska restimulated, räkna och bestråla 5×10 6 K562 CL9 mIL21 med hjälp av en gamma irradiator vid 100 Gy. Lägg till ett lika stort antal bestrålade K562 CL9 mIL21 (1:1 förhållande) och återsuspendera i NKEM på 2.5×10 5 totala celler / ml (se not 3). Seed celler i T75 kolvar (max 50 ml per flaska). Dagar 10 och 12 Räkna antalet celler. Byt hela media med färska NKEM baserade på cell nummer (se not 3). Dag 14 I slutet av två veckor av expansionen räknar antalet celler i kulturen. Ställ åt sidan 5×10 5 celler för fenotypning med flödescytometri (se not 2) Om expansionen startades från PBMC av NK-celler kan renas i detta skede av expansion med RosetteSep reningen protokollet (se avsnitt IV). Om expansionen startades från renat NK-celler vidare till stimulering 3. Efter rening avsätta 5×10 5 celler för fenotypning med flödescytometri för att verifiera renhet NK-celler (som i steg 8). Fortsätt med Stimulering 3 med hjälp av alla i det renade NK-celler (se not 4). STIMULERING 3 Resuspendera NK-celler med bestrålade K562 CL9 mIL21 (1:1 förhållande) i NKEM baserat på cell nummer (se not 3). Dagar 17 och 19 Räkna antalet celler. Ändra media med färska NKEM baserade på cell nummer (se not 3). Dag 21 Vid slutet av tre veckor av expansionen räknar antalet celler i kulturen. Återhämta 1×10 6 celler för flödescytometri analys för full NK cell fenotypning antikropp panel (se tabell 1). Frys celler i FBS som innehåller 10% DMSO högst täthet av 5×10 7 celler per flaska för framtida bruk. 3. NK cell cytotoxicitet Tina en flaska av NK-celler och utsäde i NKEM, en dag före performing cytotoxicitet för att tillåta återhämtning. För varje NK cell cytotoxicitet med en enda rad målcellen, 6×10 5 NK-celler och 3×10 5 celler mål krävs (se not 5). Förbered CAM-Media genom att späda kalcein-AM (lager 1 mg / ml i DMSO) i NKEM (se not 6). Resuspendera 10 6 målceller i 1 ml CAM-media (se not 7). Inkubera 1 timme vid 37 ° C, med tillfälliga skakningar. Resuspendera NK-celler på 1×10 6 celler / ml och tillsätt 200uL av NK cellsuspension till envar av de tre brunnar i ett U-botten 96-brunnar motsvarande till 10: 1 E: T tal visas i figur 1. (Se not 8) Lägg 100uL av kompletta media att alla återstående brunnar utom för "Maximum". Tillsätt 100uL på 2% Triton X-100 till "Max". Gör spädningar av NK-celler för de 5 kommande E: t-förhållanden genom att överföra 100uL av celler varje gång, blanda väl. Kasta 100uL från den sista brunnarna (E: T förhållandet 0.3125:1). Efter 1 timme av kalcein lastning, tvätta målceller i NKEM två gånger, centrifugering i 5 min vid 1200 rpm. (Se not 9) Re-räkna målceller och resuspendera på 1×10 5 celler / ml. Tillsätt 100 mikroliter av målceller i varje brunn (1×10 4 / brunn). Centrifugera i 1 min på 100 g att inleda cell kontakt. Inkubera vid 37 ° C och 5% CO 2 i 4 timmar. Blanda den kultur försiktigt genom att pipettera med en 100 mikroliter pipetter, för att enhetligt avbryta släppt kalcein, spinn ner plattan vid 100g i 5 minuter till pellets cellerna och överför 100 mikroliter av supernatanten till en ny platta ta hand för att undvika bubblor. Pop eventuella bubblor som bildas med fin nål. Läs plattan med hjälp av en fluorescerande plattläsaren (excitation filter 485 nm, emission filter 530 nm). Botten läsa rekommenderas. Beräkna Procent Särskilda Lysis enligt formeln [(test release-spontan frigörelse) / (max släppa – spontan frigörelse)] x 100. 4. NK cell Rening genom RosetteSep Ta 100-faldig över RBK som PBMC eller expanderade celler i ett 50 ml rör (100:1 RBC: PBMC). Om du använder färska röda blodkroppar gå direkt till nästa steg, eller om de röda blodkropparna har lagrats i Alsever s lösning, räkna antalet röda blodkroppar och tvätta lämplig (100 gånger överskotts-) mängd av röda blodkroppar med PBS kompletteras med 2% FBS tre gånger, centrifugering vid 1200 rpm i 10 minuter varje gång. Kombinera röda blodkropparna med PBMC från steg 1,7 eller utökade celler från steg 2,10 i PBS + 2% FBS till en slutlig volym på 1 ml per 5×10 7 av PBMC eller utökade celler. Lägg 1μL av RosetteSep mänskliga NK Cell Anrikning Cocktail per 1×10 6 av PBMC eller utökade celler. Blanda väl och inkubera vid rumstemperatur i 20 minuter med varsam blandning var 5 minuter. Tillsätt lika volym PBS + 2% FBS blanda försiktigt och lager ovanpå Ficoll-Paque. Upprepa steg Ficoll-Paque centrifugering beskrivs för PBMC isolering (avsnitt I). Räkna NK-celler återhämtat sig efter rening och avsatt 5×105 celler för phenotpying med flödescytometri för NK cell renhet (steg 8). 5. Anteckningar NOT 1. NK-celler kan byggas ut direkt från PBMC, eller från RosetteSep renat NK-celler. Vi har noterat liknande expansion effektivitet, men vissa givare kan ha mycket låga NK-cell nummer resulterar i svårigheter rena genom RosetteSep före expansion. NOT 2. Vi använder rutinmässigt CD56-FITC, CD16-PE, och CD3-PE-Cy5 för fenotypning under expansion, räkna NK-celler som de som CD3-negativa och CD16-eller CD56-positiv. NOT 3. Vid varje media ändra eller stimulans, för att resuspendera celler vid 2,5 x 10 5 / ml hålla PBMC / NK-celler vid eller under 2 miljoner per ml på topp skeden av expansion. Detta kommer att förhindra utarmning av näringsämnen och bidra till att uppnå maximal tillväxt och överlevnad. NOT 4. NK expansionstakt är givare beroende och i slutet av stimuli 1 eller 2 delar av cellerna kan frysas och en del expanderade ytterligare beroende på den experimentella behov. Vi har haft god framgång i att använda den frusna celler för utbyggnader vid ett senare tillfälle. NOT 5. För att ge utrymme för misstag vi rekommenderar att du använder ett minimum av 7×10 5 NK-celler resuspenderas i 700 ULS av NKEM och 4×10 5 kalcein-AM färgade celler mål suspenderade i 4 ml NKEM för inrättandet av cytotoxicitet. Om du använder flerkanalspipett för sådd målceller högre volymer av celler (upp till 6×10 5 i 6 ml) kan vara skyldig baserat på storleken av media bassäng som används. Även det rekommenderade NK-celler är specifikt för E: T nyckeltal visar i protokollet, för att använda högre E: t-förhållanden ökarNK cell nummer per ml därefter (t.ex. för ett 40:1 E: T tal använda 4×10 6 celler / ml) NOT 6. Vi rekommenderar att utföra en preliminär kalcein-AM lastning titrering för målcellen raden av val, med hjälp av följande spädningar av 1:500, 1:400. 1:300, 1:200 och 1:100 för att uppnå optimal skillnaden mellan högsta och spontan frigörelse. NOT 7. När man använder en anhängare cellinje som mål, först förbereda enda cell suspensionen med hjälp av icke-enzymatisk cell dissociation buffert. Om du utför ADCC, förbereda en dubblett tub målceller i CAM-media. NOT 8 Om du utför ADCC, lägga samma NK-celler till 3 brunnar vilket motsvarar 10:01 E:. T för ADCC. Upprepa för ytterligare givare. Upprepa för ytterligare mål celler. NOT 9. Om du utför en ADCC experiment, efter 45 minuter av kalcein lastning, lägga 10ug av antikropp som är specifik för att förmå ADCC mot målceller. Efter 15 minuter, tvätta målceller i fullständig medelstora två gånger, centrifugering i 5 min vid 1200 rpm. Resuspendera cellerna i 1×10 5 celler / ml och fortsätt med nästa steg i protokollet. 6. Representativa resultat Figur 2. När utbyggnaden sker enligt den ordning som beskrivs ovan, med 5×106 PBMC som utgångsmaterial, typisk NK ger cellområde från 1×10 oktober 9 till 10 celler (donator beroende variabilitet). Figuren visar NK-celler gånger expansion (n = 19) jämfört med NK-celler som finns i den ursprungliga produkten (median + / – kvartilen). Figur 3. Expanderade NK-celler uttrycker olika NK-cell receptorer som är jämförbara med de oexpanderade primära NK-celler med några få undantag (CD11b, CD160 och CD244). Figur 4. PBMC återhämtning från Buffy coat är givare beroende och kan variera från 300×10 6 till 800×10 6. NK-celler kan omfatta 2% – 18% av PBMC. För RosetteSep rening av utökade celler, återvinning av rena NK-celler på dag 14 varierar från 40-70%. Genom att följa den rekommenderade protokoll av expansion och rening, kan NK-celler renhetsgrad av 99% förväntas. Figur 5. Expanderade NK-celler har visat cytotoxicitet mot ett antal tumörcellinjer inklusive neuroblastom, AML, osteosarkom och melanom (representant AML döda visas som procent specifika lys).