Farelerde Görüntü Bakteriyel Enfeksiyonlar Lusiferaz Kullanımı
Summary
Yaşayan hayvanların bakteriyel enfeksiyonlar biyoparlaklık görüntüleme yöntemleri açıklanmıştır. Patojenler, canlı hayvanlarda enfeksiyon optik tüm vücut görüntüleme sağlayan lusiferaz ifade etmek için modifiye edilmiştir. Hayvan modelleri lusiferaz ifade patojenler ile enfekte olan ve hastalık ortaya çıkan ders biyoparlaklık görüntüleme ile gerçek zamanlı olarak görüntülenebilmekte.
Abstract
Görüntüleme biyolojik süreçleri izlemek için kullanılan değerli bir tekniktir. Özellikle, kanser hücreleri, kök hücreleri, spesifik immün hücre tipleri, viral patojenler, parazit ve bakterilerin varlığı hayvanlar 1-2 yaşam içinde gerçek zamanlı olarak takip edilebilir. Patojenlerin çalışmaya biyoparlaklık görüntüleme Uygulama 3-4 hayvan modellerinde enfeksiyon analiz için geleneksel stratejiler kıyasla avantajları vardır. Enfeksiyonlar, zamanla patojenin yerini ve miktarını belirlemek için ötenazi gerektirmeden bireysel hayvanlar içinde görüntülenir olabilir. Optik görüntüleme, daha önce enfekte olduğu bilinen sitelerin örnekleme yerine, tüm doku ve organları kapsamlı inceleme sağlar. Buna ek olarak, belirli dokulara aşılama doğruluğunu doğrudan başarısız tüm deney boyunca ekildi önce ileri hayvanları taşıyan belirlenir. Görüntüleme, her hayvan ayrı ayrı takip edilmesi gereken hayvanlar arasında değişkenlik, kontrol edilebilir. Görüntüleme çünkü yeteneği 3-4 patojen yükü belirlemek için örnek dokulara kalmadan birçok noktadan veri elde etmek için gereken hayvan sayısının büyük ölçüde azaltma potansiyeli vardır.
Bu protokol, canlı hayvanlarda enfeksiyonlara lusiferaz ifade rekombinant bakteri suşları için biyoparlaklık görüntüleme kullanarak görselleştirmek için yöntemler anlatılmaktadır. Tıklayın böceği (CBRLuc) ve ateşböceği luciferases (FFluc) bir substrat luciferase 5-6 olarak kullanmaktadır. CBRluc ve FFluc tarafından üretilen ışık, canlı hayvan modelleri 7-9 optik görüntüleme için bu luciferases mükemmel gazetecilere, 500 nm'den 700 nm'ye kadar geniş bir dalga boyu vardır. 600 nm'den daha fazla ışık dalga boyu, hemoglobin tarafından emilimini önlemek ve böylece verimli memeli doku yoluyla seyahat etmek gereklidir, çünkü bu öncelikle. Lusiferaz genetik ışık sinyali üretmek için 10 bakteri girmiş. Fare akciğer enfeksiyonları gerçek zamanlı olarak izlenmesine olanak intratrakeal bioluminescent bakteri inoküle. Luciferase enjeksiyondan sonra, görüntüler IVIS Görüntüleme Sistemi kullanılarak elde edilir. Görüntüleme sırasında, fare XGI-8 Gaz Anethesia Sistemi kullanılarak izofluran anestezisi. Görüntüler, yerelleştirme ve sinyal kaynağını, sırasıyla, bakteriyel enfeksiyon site (ler) ve sayı temsil eden ölçmek için analiz edilebilir. Görüntüleme sonra, CFU belirlenmesi bakteri varlığını doğrulamak için homojenize dokusu üzerinde yapılır. Bakterilerin çeşitli dozlarda lüminesans bakteri sayısı ilişkilendirmek için kullanılır. Görüntüleme patogenezi ve antibakteriyel bileşikler ve aşıların etkinliğini değerlendirme çalışması yapılabilir.
Protocol
Discussion
Bu protokoller genellikle yüksek kaliteli görüntüler neden olmakla birlikte, bu görüntüleme çalışmalarından elde edilen doğru ve tutarlı verilerin elde etmek için birkaç temel sorunları dikkate almak önemlidir. Lüminesans görüntü sinyali arka plan üzerinde ve kamera doymuş değildir sağlamak için 600 ila 60.000 sayımlar elde edilmelidir. Elde edilen sinyal 600 den az ise maruz kalma koşullarını sayımı artırmak için ayarlanabilir olmalıdır. 60.000 'den fazla elde edilen sinyal ise, …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar, bu çalışma boyunca değerli tartışmalar ve yardım için Cirillo laboratuvar üyelerine teşekkür ederiz. Biz bu protokolün çekimler sırasında Dr Joshua Hill ve Dr James Samuel laboratuvar yardım için teşekkür ederim. Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri Bill & Melinda Gates Vakfı ve hibe AI47866 hibe 48.523 tarafından finanse edildi.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Isoflurane | VETONE | 501027 | ||
| Ketamine | Butler animal health supply | |||
| Xylazine | MP Biomedical | 158307 | ||
| Luciferin | GMT | LUCK-100 | ||
| Fetal plus solution | VOR tech pharmaceutical | |||
| Cathether (22G x 1”) | TERUMO | OX2225CA | ||
| Guide wire | Hallowell EMC | 210A3491 | ||
| Octocope with speculum | Hallowell EMC | 000A3748 | ||
| Xenogen IVIS system | Caliper Life Sciences | |||
| XGI-8-gas Anesthsia System | Caliper Life Sciences | |||
| Living Imaging Software | Caliper Life Sciences | |||
| Transparent nose cones | Caliper Life Sciences | |||
| Light baffle divider | Caliper Life Sciences |
References
- Wilson, T., Hastings, J. W. Bioluminescence. Annu Rev Cell Dev Biol. 14, 197-230 (1998).
- Contag, C. H., Bachmann, M. H. Advances in in vivo bioluminescence imaging of gene expression. Annu Rev Biomed Eng. 4, 235-260 (2002).
- Hutchens, M., Luker, G. D. Applications of bioluminescence imaging to the study of infectious diseases. Cell Microbiol. 9, 2315-2322 (2007).
- Doyle, T. C., Burns, S. M., Contag, C. H. In vivo bioluminescence imaging for integrated studies of infection. Cell Microbiol. 6, 303-317 (2004).
- Wood, K. V., Lam, Y. A., Seliger, H. H., McElroy, W. D. Complementary DNA coding click beetle luciferases can elicit bioluminescence of different colors. Science. 244, 700-702 (1989).
- Wet, J. R. d. e., Wood, K. V., Helinski, D. R., DeLuca, M. Cloning of firefly luciferase cDNA and the expression of active luciferase in Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci U S A. 82, 7870-7873 (1985).
- Hastings, J. W. Chemistries and colors of bioluminescent reactions: a review. Gene. 173, 5-11 (1996).
- Zhao, H. Emission spectra of bioluminescent reporters and interaction with mammalian tissue determine the sensitivity of detection in vivo. J Biomed Opt. 10, 41210-41210 (2005).
- Rice, B. W., Cable, M. D., Nelson, M. B. In vivo imaging of light-emitting probes. J Biomed Opt. 6, 432-440 (2001).
- Contag, C. H. Photonic detection of bacterial pathogens in living hosts. Mol Microbiol. 18, 593-603 (1995).
- Kuo, C., Coquoz, O., Troy, T. L., Xu, H., Rice, B. W. Three-dimensional reconstruction of in vivo bioluminescent sources based on multispectral imaging. J Biomed Opt. 12, 024007-024007 (2007).
- Weissleder, R. A clearer vision for in vivo imaging. Nat Biotechnol. 19, 316-317 (2001).
