पृथक गुर्दे धमनी आड़ के लिए एक हैंगिंग वजन सिस्टम का प्रयोग

Summary

तीव्र गुर्दे की चोट के लिए एक सटीक murine मॉडल (अकी) ischemia के कारण तीव्र गुर्दे चोट की जांच और संभवतः चिकित्सकीय उपकरण के लिए गुर्दे की चोट का इलाज खोजने के एक महत्वपूर्ण उपकरण है. फांसी वजन प्रणाली गुर्दे की भीड़ के कारण के बिना तत्काल और विश्वसनीय गुर्दे धमनी रोड़ा और reperfusion के लिए एक उपकरण प्रदान करता है.

Abstract

In hospitalized patients, over 50% of cases of acute kidney injury (AKI) are caused by renal ischemia ^1-3. A recent study of hospitalized patients revealed that only a mild increase in serum creatinine levels (0.3 to 0.4 mg/dl) is associated with a 70% greater risk of death than in persons without any increase ¹. Along these lines, surgical procedures requiring cross-clamping of the aorta and renal vessels are associated with a renal failure rates of up to 30% ⁴. Similarly, AKI after cardiac surgery occurs in over 10% of patients under normal circumstances and is associated with dramatic increases in mortality. AKI are also common complications after liver transplantation. At least 8-17% of patients end up requiring renal replacement therapy ⁵. Moreover, delayed graft function due to tubule cell injury during kidney transplantation is frequently related to ischemia-associated AKI ⁶. Moreover, AKI occurs in approximately 20% of patients suffering from sepsis ⁶.The occurrence of AKI is associated with dramatic increases of morbidity and mortality ¹. Therapeutic approaches are very limited and the majority of interventional trials in AKI have failed in humans. Therefore, additional therapeutic modalities to prevent renal injury from ischemia are urgently needed ^{3, 7-9}.

To elucidate mechanisms of renal injury due to ischemia and possible therapeutic strategies murine models are intensively required ^7-13. Mouse models provide the possibility of utilizing different genetic models including gene-targeted mice and tissue specific gene-targeted mice (cre-flox system). However, murine renal ischemia is technically challenging and experimental details significantly influence results. We performed a systematic evaluation of a novel model for isolated renal artery occlusion in mice, which specifically avoids the use of clamping or suturing the renal pedicle ¹⁴. This model requires a nephrectomy of the right kidney since ischemia can be only performed in one kidney due to the experimental setting. In fact, by using a hanging-weight system, the renal artery is only instrumented once throughout the surgical procedure. In addition, no venous or urethral obstruction occurs with this technique. We could demonstrate time-dose-dependent and highly reproducible renal injury with ischemia by measuring serum creatinine. Moreover, when comparing this new model with conventional clamping of the whole pedicle, renal protection by ischemic preconditioning is more profound and more reliable. Therefore his new technique might be useful for other researchers who are working in the field of acute kidney injury.

Protocol

जनरल टिप्पणी सभी आपरेशनों एक ईमानदार विदारक माइक्रोस्कोप (Leica) के तहत और एक शल्य चिकित्सा coagulator का उपयोग करके किया जाना चाहिए. प्रयोगात्मक समूहों में चूहों की उम्र और वजन में मिलान किया जाना चाहिए करने के लिए परिणामों की तुलनात्मकता सुनिश्चित. प्रयोग के दौरान तापमान, रक्तचाप, संज्ञाहरण, और तरल पदार्थ प्रशासन स्थिर और निगरानी किया जाना चाहिए. 1. संज्ञाहरण और सर्जरी गुर्दे ischemia के प्रयोगों या तो एक साथ दोनों गुर्दे ischemia और reperfusion के आवेदन, या शेष गुर्दे की ischemia के उपचार के साथ संयोजन में एक nephrectomy के बाद के साथ किया जा सकता है. दोनों गुर्दे की द्विपक्षीय ischemia इलाज के रूप में वृद्धि की तकनीकी कठिनाइयों, एक और अधिक जटिल प्रयोगात्मक सेटिंग और अब सर्जरी के साथ जुड़ा हुआ है, हम एक सही एक फांसी वजन सिस्टम का उपयोग करके शेष बाएँ गुर्दे के उपचार ischemia के द्वारा पीछा किया nephrectomy प्रदर्शन करेंगे. हम इस फांसी वजन प्रणाली भी दिल में कोरोनरी धमनी रोड़ा के लिए उपयोग. हालांकि, प्रक्रिया अलग है क्योंकि गुर्दे धमनी आसपास के ऊतकों से अलग किया जा सकता है जबकि कोरोनरी धमनी हृदय की मांसपेशियों के भीतर निहित है. चूहे (उम्र के 8-14 सप्ताह, या तो सेक्स) 70mg/kg की एक खुराक पर pentobarbital साथ anesthetized जाएगा. हम लगभग साथ संज्ञाहरण बनाए रखना होगा. 10 मिलीग्राम / किग्रा / h pentobarbital सोडियम. Overdosing काफी रक्तचाप को कम कर सकते हैं और इस तरह के परिणाम बदल सकते हैं. हमारे प्रारंभिक अध्ययन में हम भी Ketamine और xylazine इस्तेमाल किया. हालांकि, इन यौगिकों एक मजबूत bradycardia (150 मिनट /) प्रेरित किया. बगल में मनाया bradycardia वहाँ भी सबूत है कि दोनों यौगिकों ischemia की शर्तों के दौरान सुरक्षा तंत्र में शामिल हैं. अस्थिर anesthetics या तो उनकी क्षमता की वजह से इस्तेमाल नहीं किया जा करने के लिए भी गुर्दे संरक्षण और निम्न रक्तचाप पैदा कर सकते हैं. इसलिए हमारे संज्ञाहरण के लिए अंतिम विकल्प pentobarbital था. इसके अलावा, ketamine और xylazine मुख्य रूप से गुर्दों द्वारा उत्सर्जित कर रहे हैं. Nephrectomy और ischemia ketamine संज्ञाहरण लम्बा हो सकता है. एक बार दर्द सजगता अनुपस्थित रहे हैं चूहों (चिमटी के साथ पैर की उंगलियों फैलाएंगे द्वारा परीक्षण) तापमान नियंत्रित हीटिंग मेज पर रखा जाएगा एक बाएं पार्श्व decubitus स्थिति में (आरटी, Effenberg, म्यूनिख, जर्मनी 37.0 डिग्री सेल्सियस पर शरीर का तापमान बनाए रखने के). मेज पर टेप का उपयोग करके निचले और ऊपरी extremities संलग्न. जैसे वीडियो प्रदर्शन में दिखाया गया है गैर अस्तित्व सर्जरी के लिए, खनिज तेल के साथ चीरा क्षेत्र को कवर माउस बालों की साँस लेना त्वचा को काटने से रोकने के लिए और इस तरह माउस बाल एलर्जी के जोखिम को रोकने. अस्तित्व प्रयोगों के मामले में बालों की कतरन, त्वचा की iodophors (जैसे Betadine), autoclaved उपकरणों की बाँझ से निपटने और मास्क का उपयोग सर्जन के लिए एक बाँझ दस्ताने के साथ कीटाणुशोधन सहित उचित सड़न रोकनेवाला तकनीक की आवश्यकता हैं. खनिज तेल अस्तित्व सर्जरी में इस्तेमाल नहीं किया है. अस्तित्व सर्जरी के लिए बाँझ NaCl प्रयोग किया जाता है सही दिशा चीरा एक कैंची और एक जमावट इलेक्ट्रोड (Erbe, ICC50, जर्मनी) के लिए मांसपेशियों और त्वचा जहाजों के खून बह रहा को रोकने के साथ प्रदर्शन किया जाएगा. Midline laparotomy के माध्यम से गुर्दे तक पहुँचने के विपरीत, इस तकनीक peritoneal गुहा के लिए उपयोग की आवश्यकता नहीं है. गुर्दे की धमनी और गुर्दे की नस सहित गुर्दे की डंडी 4 / 0 रेशम सिवनी और सही गुर्दे एक कैंची के साथ बाहर हो जाएगा अधिवृक्क वाहिकाओं के साथ हस्तक्षेप किए बिना कटौती का उपयोग ligated हैं. सर्जिकल घाव मांसपेशियों और एक 4 / 0 सीवन के साथ दीवार त्वचा के निरंतर सिवनी (दो टांके) का उपयोग करने के लिए बंद कर दिया है. पशु तो एक सही पार्श्व decubitus स्थिति में रखा जाता है और बायीं ओर चीरा प्रदर्शन किया जाएगा. बाएँ गुर्दे ध्यान संयोजी ऊतकों से हटा दिया जाता है, अधिवृक्क ग्रंथि और जहाजों से बचने. अगला, गुर्दे अपने उदर पक्ष के साथ एक lucite कप में ठुकरा दिया है. lucite कप अस्तित्व सर्जरी के लिए निष्फल होना चाहिए. गुर्दे की पोल ध्यान से एक संदंश के साथ आसपास के ऊतकों धारण द्वारा lucite कप में धकेल दिया है. इसके बाद पोल ध्यान से एक संदंश के साथ lucite कप में धकेल दिया है. गुर्दे एक गीला 37.0 पर पानी से लथपथ झाड़ू ° सी. के साथ गीला है और गर्म रखा जाएगा बाएँ गुर्दे और प्लेसमेंट का एक lucite कप में जोखिम के बाद गुर्दे धारक ventrally रोका है गुर्दे जहाजों पर तनाव है. एक पर्याप्त निरोधक वृक्क धमनी के तहत एक सीवन के सफल नियुक्ति के लिए महत्वपूर्ण है. इसके बाद गुर्दे धारक तय है और वृक्क धमनी आसानी से के रूप में यह गुर्दे की नस चोटी पर चलाता है की पहचान कर सकते हैं. वृक्क धमनी आसन्न ऊतकों से dissected है, इसके ठीक संदंश के साथ पेट महाधमनी से ले बंद पास. धमनी बहुत शीर्ष पर एक घुमावदार संदंश के साथ अंतर्निहित नस से dissected है. का उपयोग करके एक 8 / 0 रेशम सीवन (Ethicon, Norderstedt, जर्मनी) वृक्क धमनी के तहत रखा गया हैएक अग्रणी गाइड के रूप में एक संदंश. इस तकनीक को गुर्दे की नस के संपीड़न के बिना केवल गुर्दे धमनियों से रक्त प्रवाह में रुकावट की अनुमति देता है, के रूप गुर्दे डंडी तुलना clamping. सीवन एक छोटे (एक तैयार सुरक्षा पिन किया जा सकता है है) पोल और लगभग एक वजन पर रखा गया है. 1g प्रत्येक के अंत से जुड़ा हुआ है (Eppendorf ट्यूब). वजन गुर्दे के आकार के लिए बाहर ले या Eppendorf ट्यूबों में पानी जोड़ने के द्वारा अनुकूलित किया जा सकता है. हालांकि, धमनी थोड़ा ऊपर की तरफ खींच चाहिए, ताकि कोई रक्त धमनी के माध्यम से, लेकिन धमनी पर प्रमुख खिंचाव के बिना चल रहा है. धमनी पर मेजर खिंचाव तनाव धमनियों की दीवार का उमड़ना और कम reperfusion के साथ पोत दीवार क्षति पैदा कर सकता है. जबकि वजन असमर्थित हैं, वृक्क धमनी तुरंत occluded है. इसके विपरीत, जब वजन का समर्थन कर रहे हैं, रक्त के प्रवाह को तुरंत अंग को बहाल है. सफल रोड़ा लाल से सफेद रंग का एक परिवर्तन के द्वारा पुष्टि की है. विभिन्न ischemia बार के रूप में प्रयोग द्वारा अपेक्षित किया जा सकता है है. एक पूरा reperfusion की जगह ischemia समय की लंबाई के आधार पर ले जाएगा. 45 मिनट के लिए ऊपर Ischemia बार वसूली गुर्दे चोट अनुमति देते हैं. हमारे प्रयोगात्मक सेटिंग में हम एक मध्यम गुर्दे की चोट है जो हमें माउस तनाव और उपचार पर निर्भर करता है गुर्दे की क्षति के रूप में के रूप में अच्छी तरह से हानि सुधार देखने के लिए अनुमति देता है के साथ ischemia के 30 मिनट के लिए 20 अप का इस्तेमाल किया. पूरा reperfusion के बाद गुर्दे lucite कप से बाहर हो प्रतिस्थापित कर सकते हैं. इसलिए गुर्दे धारक unfixed है और गुर्दे पर तनाव जारी है. कपाल पोल धीरे कप के बाहर और एक कमज़ोर संदंश के साथ हटा दिया दुम पोल तुरंत इस प्रकार है. माउस के निर्धारण (टेप) जारी किया जा सकता है और माउस जैसे FITC – inulin लेबल निकासी के लिए एक लापरवाह स्थिति में रखा जा सकता है. प्रयोगों के सबसेट में, रक्तचाप और हृदय की दर को शल्य चिकित्सा की प्रक्रिया के दौरान दर्ज किया जा सकता है. रक्त दबाव मापन लगातार एक मन्या धमनी कैथेटर के माध्यम से प्राप्त कर रहे हैं. संक्षेप में, मन्या धमनी paratracheal मांसपेशियों की कुंद विच्छेदन के माध्यम से अवगत कराया है. आगे जोखिम और ऊतक आघात (vagal तंत्रिका के विशेष) सावधान परिहार के बाद, एक कैथेटर दो sutures और एक छोटे से दबाना का उपयोग पोत में डाला जाता है. रक्तचाप एक Statham तत्व (280 WK, WKK, Kaltbrunn, स्विट्जरलैंड) के साथ मापा जाता है. FITC लेबल inulin निकासी के लिए एक कैथेटर बाईं गले नस में सोडियम क्लोराइड और FITC – लेबल inulin के अर्क के लिए रखा जाना है. इसके अलावा एक मूत्राशय कैथेटर मूत्र संग्रह के लिए एक समय निर्भर फैशन में सम्मिलित किया जा के रूप में विस्तार में नीचे समझाया गया है. 2. गुर्दे की चोट के मापन सामान्य में: निम्नलिखित परिणाम मानकों को गुर्दे ischemia के बाद गुर्दे की चोट निर्धारित करने के लिए सिफारिश कर रहे हैं: FITC लेबल inulin मंजूरी glomerular निस्पंदन दर (GFR) का आकलन करें. एक विकल्प के रूप में creatinine और चयापचय पिंजरे गुर्दे की चोट के बाद जांच 24 घंटे के माध्यम से सीरम creatinine निकासी का निर्धारण. गुर्दे एच एंड ई धुंधला हो जाना और (MPO myeloperoxidase) एलिसा गुर्दे की क्षति और गुर्दे ischemia के बाद 24 घंटे सूजन निर्धारित प्रदर्शन. मेटाबोलिक पिंजरे जांच: Ischemia के बाद छोड़ दिया गुर्दे वापस retroperitoneal स्थिति में चालू है और ऊपर वर्णित के रूप में घाव बंद है. सर्जरी के अंत में चूहों 0.3 मिलीलीटर सामान्य खारा आईपी प्राप्त और एक हीटिंग दीपक के तहत 2 घंटे के लिए ठीक है. इसके बाद चूहों गुर्दे कार्यात्मक मापदंडों के 24 घंटे के 2 बार के लिए दृढ़ संकल्प के लिए चयापचय (Tecniplast Deutschland, Hohenpeissenberg, जर्मनी) पिंजरों में रखा जाएगा. प्रत्येक माउस के पानी का सेवन माउस के लिए आपूर्ति से पहले पानी के साथ खाली और भरे बोतल वजन और पूर्ण बोतल फिर से वजन की तुलना में निर्धारित 24 घंटे बाद है. माउस वजन के रूप में अच्छी तरह से निर्धारित किया गया है. लगभग 24 घंटे बाद 75μl रक्त शिरापरक जाल के पीछे आंख से कम isoflorane संज्ञाहरण के तहत एक केशिका ट्यूब के माध्यम से ले रहे हैं. गुर्दे समारोह गुर्दे ischemia के बाद निर्माता `एस प्रोटोकॉल (LT-SYS, श्रम + टेक्निक, बर्लिन, जर्मनी) के अनुसार एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध colorimtric विधि का उपयोग कर प्लाज्मा और मूत्र क्रिएटिनिन 24 घंटे मापने के द्वारा मूल्यांकन किया है. प्लाज्मा और ना + कश्मीर के मूत्र सांद्रता + photometer लौ उत्सर्जन (Elex 6361, Eppendorf एजी, हैम्बर्ग, जर्मनी) के साथ निर्धारित कर रहे हैं . गुर्दे निकालनेवाला और hemodynamic मूल्यों मानक 15-17 सूत्रों का उपयोग कर की गणना कर रहे हैं. Inulin निकासी: FITC inulin मंजूरी प्रयोगों गुर्दे ischemia के बाद प्रदर्शन किया जाएगा. बाईं गले नस मैं निरंतर के लिए cannulated हैnfusion. आसन्न ऊतकों से एक तैयारी (Dumont, डब्ल्यूपीआई) कैंची जगह नस के आसपास दो sutures (/ 0 4) के साथ नस विदारक के बाद. Proximale रक्त के प्रवाह को रोकने के सिवनी से पहले नस पर एक क्लैंप रखें. इसके बाद बाहर का गाँठ बंद करो और एक बाहर का सिवनी को एक वजन जगह नस पर तनाव तनाव समाप्त होता है. यह बहुत महत्वपूर्ण है नस में कैथेटर. एक माइक्रो – कैंची का प्रयोग नस में एक छोटे से खोलने में कटौती. ठीक संदंश (Dumont, डब्ल्यूपीआई) के साथ खोलने पकड़ो और नस में कैथेटर जगह है. अग्रिम कैथेटर क्लैंप से दूर ले. सुनिश्चित करें कि वहाँ कैथेटर पर कोई तनाव नहीं है कि ताकि आप इसे पकड़ के बिना नीचे जगह कर सकते हैं. इसके बाद दूसरा प्रॉक्सिमल सीवन नस और कैथेटर से अधिक करीब है. संग्रह के लिए समय पर मूत्र मूत्राशय में एक कैथेटर रखा गया है. इसलिए आप मूत्राशय पर एक त्वचा में कम चीरा काटा. ध्यान से त्वचा के छेद के माध्यम से मूत्राशय हटा दें. एक गीले टिश्यू के साथ मूत्राशय को ठीक करें. मूत्राशय (/ 0 4) पर एक तैयार सीवन रखें. एक कैथेटर के एक छोटे टुकड़े (1.5cm) और गर्मी अंत पर कैथेटर जो यह आसान यह मूत्राशय में तय करने के लिए बनाता है चारों ओर एक अंगूठी कट. मूत्राशय में इसकी बहुत शीर्ष पर एक छेद काटें. रक्तस्राव को रोकने के जहाजों के बीच में कटौती करें. मूत्राशय में कैथेटर के बड़े अंत डालें और कैथेटर और मूत्राशय पर सीवन बंद. सभी चूहों एक शरीर के वजन के 20% के बराबर राशि में 0.85% सोडियम क्लोराइड समाधान के एक सांस में प्राप्त करते हैं. निरंतर प्रेरणा शरीर के वजन 800ul/h/25g और FITC inulin पूरे गुर्दा glomerular निस्पंदन दर (GFR) के मूल्यांकन के लिए अर्क के लिए जोड़ा जाता है एक दर पर बनाए रखा है. 20 मिनट के लिए पशुओं के स्थिरीकरण के बाद 20 मिनट, समय पर मूत्र संग्रह (चार बार) मूत्र प्रवाह दर और FITC – inulin के निर्धारण के लिए प्रदर्शन कर रहे हैं. रक्त FITC – inulin की माप के लिए प्रत्येक अवधि के बीच में प्राप्त की है. जब शुरू 20 मिनट के लिए संग्रह अवधि एक टाइमर का उपयोग करें. एक छोटे Eppendorf ट्यूब में मूत्राशय कैथेटर के अंत रखकर मूत्र ले लीजिए. पहले और मूत्र संग्रह के बाद इतनी है कि आप मूत्र राशि निर्धारित कर सकते हैं ट्यूब वजन उपाय. प्रत्येक संग्रह अवधि के बीच में केशिका ट्यूब के माध्यम से retroorbital रक्त संग्रह प्रपत्र शिरापरक जाल के माध्यम से रक्त के नमूने ले रहे हैं. रक्त और गुर्दे आगे के विश्लेषण जैसे MPO एलिसा, साइटोकाइन EISA, ऊतक विज्ञान के लिए प्रत्येक प्रक्रिया के बाद एकत्र किया जा सकता है है. 3. प्रतिनिधि परिणाम: चित्रा 1 फांसी वजन गुर्दे ischemia के लिए एक प्रणाली के मॉडल: एक फांसी वजन प्रणाली बाएँ गुर्दे के गुर्दे ischemia प्रेरित करने के लिए स्थापित किया गया है. इसलिए एक 8.0 नायलॉन सीवन वृक्क धमनी के तहत रखा गया था और प्रत्येक सीवन के अंत में एक छोटे से वजन (1g) संलग्न किया गया था. इस प्रयोगात्मक डिजाइन को लागू करने और वजन लोड द्वारा जारी वृक्क धमनी की प्रतिवर्ती रोड़ा अनुमति देता है.

Discussion

संक्षेप में, वर्तमान अध्ययन वृक्क धमनी रोड़ा के लिए फांसी वजन एक प्रणाली का उपयोग कर एक murine मॉडल में गुर्दे ischemia के प्रदर्शन के लिए एक उपन्यास तकनीक का वर्णन करता है. वास्तव में, इस अध्ययन अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य चोट को दर्शाता है, इस प्रकार गुर्दे की डंडी की clamping के साथ जुड़े परिवर्तनशीलता कम से कम.

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments
Sodium Pentobarbital	Vortech Pharmaceutical Ls, Ltd	V.P.L. 9372	4mg/mL in saline
Suture, silk 4.0	Harvard Apparatus	517698
Suture, Prolene 8.0	Ethicon, USA	M8739	reusable
dissecting microscope	Leica	n/a	consider generous working distance
Heating Table	Rt, Effenberger, Germany	n/a	only and single provider
Surgical instruments	WPI, Dumont		a fine microvessel scissor