1. RNA-Extração: células cultivadas em monocamada (Seguindo o protocolo do fabricante e utilizando TRIzol.) Nome do reagente Companhia Prod / Cat # Solução TRIzol Invitrogen 15596-018 Álcool isopropílico Sigma-Aldrich 1907-1964 Clorofórmio Sigma-Aldrich C 2432 Etanol RNAse água livre Homogeneização Homogeneizar as células diretamente na placa de cultura pela adição de 1 ml da solução Trizol por 10 cm 2 área prato, redemoinho do Trizol ao redor e pipeta cima e para baixo para garantir a cobertura completa da placa. Separação de Fase Incubar a amostra homogeneizada por 5 minutos em temperatura ambiente. Transferir para um tubo rotulado, adicione 0,2 ml de clorofórmio por 1ml TrizolSolution e agitar vigorosamente à mão tubo por 15 segundos. Incubar à temperatura ambiente por 3 minutos. Centrifugar a amostra a 12.000 xg por 15 minutos a 2 ° C. Após a centrifugação, a mistura se separa em uma fase inferior vermelha, uma interfase e uma fase superior aquosa incolor, que contém o RNA e deve ser de 60% do volume total de solução Trizol. RNA Precipitação Transferir a solução aquosa, contendo RNA fase em um tubo, fresco rotulados. Precipitar o RNA, adicionando 0,5 ml de álcool isopropílico por 1 ml de solução Trizol. Incubar as amostras à temperatura ambiente por 10 minutos. Centrifugar a 12.000 xg por 10 minutos a 2 ° C. RNA-lavagem Após a centrifugação, desprezar o sobrenadante dos tubos. Lave o pellet de RNA (na lateral e fundo do tubo), adicionando pelo menos 1 ml de etanol 75% por 1 ml de Trizol Solution, vórtice. Centrifugar a 7500 xg por 5 minutos a 2 ° C. RNA de eluição Desprezar o sobrenadante e centrifugar novamente por 1 minuto. Remover o líquido em excesso. De ar seco pellet por 5-10 minutos. Nota: mais de RNA secas é difícil para solubilizar. Dissolver o sedimento em água livre de RNase pipetando a solução cima e para baixo e incubar por 10 minutos a 55 ° C. Medida RNA concentração (A260/280 ratio) usando um espectrofotômetro ™ Nanodrop. Armazenar a -80 ° C até que esteja pronto para uso. 2. RNA-Extração: Soro (Protocolo Após Mirvana PARIS fabricante do Kit modificado por Mitchell et al. 1) Nome do reagente Companhia Prod / Cat # Comentários mir Vana PARIS Kit Solução de desnaturação 2X Ácido Fenol: Clorofórmio Solução miRNA Wash 1 Solução miRNA Wash 03/02 Ambion AM1556 Modificações no protocolo de 2-mercaptoetanol Sigma-Aldrich M7522 Etanol DEPC água tratada Preparação química: Adicionar 375 mL de 2-mercaptoetanol para a solução 2X de desnaturação e misture bem. Adicionar 21 ml de etanol a 100% para a lavagem Solução miRNA 1. Adicionar 40 ml de etanol a 100% para a solução de lavagem miRNA 03/02. Preparação da amostra: Descongelar amostra de soro no gelo. Homogeneização Misturar 300 mL da amostra com um volume igual (300 ml) de solução de desnaturação 2X (devem estar à temperatura ambiente) e vortex. Incubar a mistura em gelo durante 5 minutos. Adicionar um volume de ácido Fenol: Clorofórmio igual ao volume total da amostra mais o lisado Solução 2X de desnaturação (600 mL). Importante: NÃO use o tampão aquoso, que se situa no topo do Acid-Fenol: Clorofórmio. Mistura Vortex por 60 segundos. Centrifugar em temperatura ambiente por 15 minutos na velocidade máxima (> xg 10.000). Após a centrifugação, a mistura se separa em uma fase aquosa superior, uma interfase e uma menor fase orgânica. Remover aqueous camada em cima (deve ser 300-500 mL incluindo qualquer proteinacious camada de "nebuloso"). Re-extrair camada aquosa como antes, novamente adicionando clorofórmio. Importante: A camada aquosa da extração segundo é rotineiramente menor em volume (250 mL). Anotar o volume recuperado. Preparação de Final RNA-Isolation (RNA total) Pré-aquecimento (95 ° C) nuclease sem água. Etanol 100% deve estar à temperatura ambiente. Final de RNA-Isolation (RNA total) Adicionar 1,25 volumes de etanol 100% recuperado para a fase aquosa (por exemplo, se 300 ml foi recuperado, adicione 375 mL de etanol) e misture bem. Para cada amostra, colocar um cartucho de filtro em um dos tubos de coleta. Pipetar o lisado para o filtro. Centrifugação (10.000 xg) por 30 segundos, descarte o fluxo-through, centrifugar novamente por 30 segundos e substituir o cartucho de filtro no tubo de coleta mesma. RNA-Wash Aplicar 700 mL de solução de lavagem miRNA 1 para o cartucho de filtro e centrifugar por 15 segundos, descartar o fluxo através do tubo de coleta, e substitua o cartucho de filtro no tubo de coleta mesma. Aplicar 500 mL de solução de lavagem miRNA 03/02, centrifugar por 15 segundos, descartar o fluxo através de e repita com um mL 500 segundo de solução de lavagem 03/02. Descartar o fluxo através de e seca-spin por 1-2 minutos. Cartucho de filtro lugar em um tubo de coleta de fresco, aplicar 100 ml de água livre de RNAse (95 ° C), cap perto e incubar por 2 minutos. Centrífuga para a 2 minutos para recuperar o RNA. Armazenar a -80 ° C até o uso. 3. Concentração de RNA-Solution (5X) (Seguindo o protocolo do fabricante) Nome do reagente Companhia Prod / Cat # Microcontrolador Centrífuga Dispositivos Filter, Ultracell YM-3 Millipore 42404 DEPC água tratada Dispositivo: microcontrolador Ultracell YM-3, Cutoff SS e DS Nucleotídeos: 10 Volume: volume desejado de re-solução concentrada RNA depende do desenho experimental e deve incluir experimentos de controle. Inserir reservatório de amostra microcontrolador no frasco e solução pipeta no reservatório. Nota: Não toque na membrana. Centrifugar durante 185 minutos a 4 ° C, com máxima 14.000 x g. Nota: Posição frasco com a banda de crack para o rotor. Pipetar volume desejado de água livre de RNAse (por exemplo, 20 l) para o reservatório, reservatório lugar invertido em um novo frasco e girar por 3 minutos a 4 ° C, com máxima 3000 x g. Armazenar a -80 ° C até o uso. 4. Transcrição Reversa (Na sequência de um protocolo por Tang et al. 2 com modificações.) Nome do reagente Companhia Prod / Cat # Comentários Alta capacidade kit arquivo cDNA Tampão de cDNA 10x arquivamento dNTP (100 mM) Moloney vírus da leucemia murina (MMLV) transcriptase reversa (50 U / mL) Applied Biosystems 4368814 modificações no protocolo de RNaseOUT (40 U mL /) Invitrogen 10777019 x-plex reverter a mistura de iniciadores haste-laço (40 nM) * Integrada DNA Technologies Personalizado Seqüências * DEPC água tratada Volume de reação: 5,5 mL Nota: a concentração final dos primers haste-laço deve ser 1-5 nM (aqui 2 nM). Prepare-Master Mix (Volumes por reação) como segue: 1. DEPC-Água 1,959 mL 2. 10x RT-Buffer 0,55 mL 3. Inibidor de RNase (40 U mL /) 0,0715 mL 4. dNTP (100 mM) 0,275 mL 5. x-plex reverter a mistura de iniciadores haste-laço (40 nM) * 0,275 mL 6. MMLV-RT (50 U mL /) 0,369 mL Mix e brevemente centrífuga. Adicionar 3,5 mL Master Mix-a 2 mL da amostra. Execute o seguinte RT-reação: 16 ° C por 30 minutos, seguido de 60 ciclos a 20 ° C por 30 segundos, 42 ° C por 30 segundos, 50 ° C durante 1 segundo e finalmente 85 ° C por 5 minutos para inativar MMLV-RT, 4 ° C ∞ . Armazenar a -20 ° C até o uso. * Lista de reverter haste-laço primers podem ser encontradas em http://urology.ucsf.edu/blellochlab/protocols.htm 5. Pré-amplificação (Pré-PCR) (Na sequência de um protocolo por Tang et al. 2 com modificações.) Nome do reagente Companhia Prod / Cat # Comentários dNTP (100 mM) Applied Biosystems 4368814 Tampa alta. Kit arquivo cDNA. 2x Universal PCR Master Mix com NoAmpErase UNG Applied Biosystems 4324018 x-plex mix de primer para a frente (450 nM) * Integrada DNA Technologies Personalizado Seqüências * Primer Universal Reversa (100 mM) Integrada DNA Technologies Personalizado Sequência 2 AmpliTaqGold polimerase (5 U / mL) Applied Biosystems 4311806 MgCl 2 (100 mM) DEPC água tratada Volume reação: 27.5μl (22μl MM + 5.5μl RT-Produto) Nota: pré-amplificação é necessária para aumentar a força do sinal, especialmente quando a concentração inicial de RNA é limitado. A entrada de nível de RNA determina o número ideal de pré-PCR ciclos. Dada a mesma eficiência relativa de cada ciclo de PCR deve dobrar a concentração do produto final. Uma vez que alguns miRNAs será mais alta expressão, evitar o excesso de ciclismo. No entanto, em amplificação pode resultar em uma perda de sensibilidade de detecção, especialmente para microRNAs expresso em níveis baixos. Em nossas mãos 12 ciclos de amplificação pré, usando 100ng de RNA total, apareceu suficiente. Utilizando soro como matéria-prima, 12 ciclos de resultados nos níveis de miRNA detectável, mas 15 ciclos parecia ser superior. Finalmente, começando com três oócitos (cerca de 400 pg de RNA total por oócito 3), 16 ciclos de pré-amplificação com sucesso nos permitiu tela para níveis de expressão de microRNA 4. * Lista de primers para a frente pode ser encontrada em http://urology.ucsf.edu/blellochlab/protocols.htm Prepare-Master Mix (Volumes por reação) como segue: 1. 2x Universal MM 13,75 mL 2. DEPC-Água 0,792 mL 3. MgCl 2 (100 mM) 0,55 mL 4. dNTP (100 mM) 1,1 mL 5. x-plex mix de primer para a frente (450 nM) 3,06 mL 6. Universal RP (100 mM) 1,375 mL 7. AmpliTaqGold polimerase (5 U / mL) 1,375 mL Misturar e centrifugar brevemente. Adicionar 22 mL Master Mix-a cada 5,5 mL RT-Produto. Realizar a reação de pré-PCR seguinte: 95 ° C por 10 min, 55 ° C por 2 min, seguido por 10-18 ciclos de 95 ° C por 1 s e 65 ° C por 1 min, 4 ° C ∞. 6. Purificação do produto pré-PCR Purificação pela seleção de tamanho em um gel de poliacrilamida 10% nativa Nome do reagente Companhia Prod / Cat # 40% de acrilamida / Solução Bis Bio-Rad 161-0144 Temed Bio-Rad 161-0801 10 escada de DNA bp Invitrogen 10821-015 SYBR Ouro gel de ácido nucléico mancha 10.000 X concentrar em DMSO Invitrogen S11494 Glicogênio (20 mg / ml) Roche 10 901 393 001 Tampão-EB Ammoniumpersulfate 10% (APS) TEN-Buffer 6x Laranja G DEPC água tratada ddH2O a. Preparação de gel Para fazer 10ml de uma mistura de poliacrilamida a 10% add 1. 2 O DDH 6,5 ml 2. TBE 10x 1 ml 3. Poliacrilamida (40%) 2,5 ml 4. APS (10%) 80 mL 5. Temed 4 mL Prepare escada de DNA: 0,5 mL 10 bp DNA ladder 4,5 mL de buffer (EB) 1 ml 6x Laranja G Adicionar 5,5 mL 6x G Laranja a cada 27,5 produto Pré-PCR mL. b. Executar Gel Executar Gel com 150V para 55-60 minutos. Nota: Azul de bromofenol como indicador funciona com região 20bp. c. Gel Stain Mancha gel com SYBR-Gold por 25 minutos em shaker. Nota: SYBR Gold-se sensível à luz. d. Corte Gel Cortar Pré-PCR banda produto 60-80 bp e transferir para tubo rotulado. Nota: A banda de baixa entrada RNA pré-PCR produtos podem não ser visíveis. Esmagar banda gel (por exemplo, em tubo de centrifugação tubo). e. Re-Extrato de cDNA Adicione 300 ml TEN-Buffer e incubar a 37 ° C por 4 horas em um rotador. Transferência de fluido para um tubo de recolha rotulado, adicione 300 mL outra TEN-Buffer para o tubo de gel contendo todos os e incubar a 4 ° C durante a noite em um rotador. Aspirar o líquido remanescente, transferir para o tubo de coleta rotulados como antes e anotar o volume total recuperado. f. Precipitação de etanol Adicionar 3 volumes de etanol à temperatura ambiente 100%. Adicionar 0,5 mL de glicogênio (20 mg / ml). Vortex. Incubar em gelo seco por pelo menos 2 horas ou a -80 ° C durante a noite. Girar em microcentrífuga a 4 ° C durante 30 minutos para pellet cDNA. Despejo líquido, adicione 700 mL de etanol a temperatura ambiente de 75% e giro por 10 minutos. Despejo fluido e girar novamente por 5 minutos. Sugar off sobrenadante sem perturbar pellet e ar seco por 10 minutos. Dissolver o sedimento em água limpa. Nota: o volume desejado da solução concentrada é cDNA dependendo do desenho experimental e deve incluir experimentos de controle. 7. Purificação do produto pré-PCR Purificação por digestão enzimática de primers seguido pela coluna spin (seguir os protocolos de fabrica) Nome do reagente Companhia Prod / Cat # ExoSAP-IT USB-Affymetrix 78250 MinElute Kit de Purificação PCR Qiagen 28004 Nota: Em nossas mãos o exclusivo enzimático de limpeza primers removido com sucesso, mas também levou a degradação parcial do produto pré-amplificados, possivelmente devido à desnaturação parcial dos produtos de curto como a temperatura sobe até 80 ° C durante a etapa de inativação do enzima. Evitando a inativação de calor e directamente purificação dos produtos de PCR da reação enzimática usando colunas de spin remove qualquer produto sem degradação do produto. Misturar 5 produto pós-PCR mL com 2 mL ExoSAP-IT. Incubar a 37 ° C por 15 minutos para se degradar primers restantes e nucleotídeos. Adicionar 5 volumes de tampão PB para 1 volume da reação de PCR e misture, se eu indicador de pH foi adicionado ao tampão PB, verifique se a cor da mistura é amarelo. Colocar uma coluna MinElute em um tubo coletor de 2 ml em um rack adequado. Aplicar a amostra para a coluna MinElute e centrifugar por 1 minuto. Descarte de fluxo, coloque a coluna MinElute de volta para o mesmo tubo e adicionar 750 mL de tampão PE para a coluna MinElute para lavar e centrifugar por 1 minuto. Descarte de fluxo e colocar a coluna volta MinElute no mesmo tubo. Centrifugar a coluna para um 1 minuto adicional na velocidade máxima. Coloque a coluna MinElute em um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Para eluir o DNA, adicionar 10 mL de água DEPC tratada para o centro da membrana, deixar a coluna por 1 minuto, e depois centrifuge por 1 minuto. 8. Fludigim 96,96 Profiling qRT-PCR Nome do reagente Companhia Prod / Cat # Comentários Fluidigm 96,96 Kit matriz dinâmica 96,96 matriz dinâmica 96,96 fluido da linha de controle 20x Reagente Loading Fluidigm Corporação Mistura de Primer Universal Reversa (1 mM) Primer para a frente (1 mM) TaqMan Probe (0,2 mM) Integrada DNA Technologies Personalizado Seqüência (1) 2x Universal PCR Master Mix com NoAmpErase UNG Applied Biosystems 4324018 Tween 1. Aprontar a 96,96 IFC matriz dinâmica Injetar fluido controle de linha (150 mL) em cada um dos acumuladores no chip. Chip de lugar para o controlador de IFC (integrado fluídico circuito) e execute o Primeiro-script (136x) para fluido principal controle de linha para o chip. Nota: Chip precisa ser usado 24 horas após a abertura do pacote. Certifique-se de não derramar o líquido da linha de controle de fluido desde controle de linha no chip ou no entradas faz o chip inutilizado. Chip precisa ser carregado dentro de 60 minutos de priming. 2. Preparação das amostras 2.1 Preparação Pré-Amostra Em um tubo de plástico descartáveis, combinar os componentes na tabela abaixo para fazer o Sample Pré-Mix (Volumes por entrada). 2x TaqMan Universal Master Mix 2,5 mL 20x Reagente Loading 0,25 mL Nota: O volume final é de 2,75 mL, como excesso de pipeta dispensar perdas 2,2 Preparação de amostras- Combine em 96 formato bem cada amostra com amostra pré-mix (Volumes por entrada). Pré-Mix-Amostra 2,75 mL Amostra 2,25 mL Nota: Vortex e placa de centrífuga de 96 poços rapidamente para recolher o líquido. Volume final por 5 mL de entrada, leve em conta a perda de pipetagem, preparando o volume um pouco maior. 2,3 Preparando o Ensaios 13x Use uma placa de 96 poços para preparar ensaios 13x. 1x concentrações na tabela abaixo, escala-se para 13x. Primer Universal Reversa 1 mícron (1x) Seqüência em duas * Primer para a frente 1 mícron (1x) * Gene específico TaqMan Probe # 0,2 m # * Lista de primers para a frente pode ser encontrada em http://urology.ucsf.edu/blellochlab/protocols.htm # Lista de Sondas TaqMan podem ser encontradas em http://urology.ucsf.edu/blellochlab/protocols.htm Combine em uma nova placa de 96 alíquotas bem dos ensaios 13x com Tween para uma concentração final de Tween 0,25% Nota: Volume final por entrada é de 5 mL, prepare um volume suficiente (5,5 mL) para tirar a perda durante a transferência de volume em conta. Misture bem, evitando bolhas e centrifugar rapidamente para recolher o líquido. 3. Carregando o chip Nota: A fim de permitir a colocação correta de amostras e ensaios de garantir o posicionamento correto do chip. É conveniente alinhar o entalhe para o canto superior esquerdo. Garantir que todos os ensaios e soluções de amostra são misturados antes de carregar o chip. É conveniente fazer isso em uma placa de 96 poços e girar o prato para baixo antes de carregar o chip. Estar ciente do mapa chip de pipetagem para referência posterior. Entradas amostra não utilizada deve ser preenchido com 2,75 mL de amostra Mix e 2,25 mL de água DNA livre. Entradas de ensaio não utilizados devem ser preenchidos com 2,5 mL de reagente de ensaio de carga e 2,5 mL de água. Não passar a primeira parada enquanto pipetagem para evitar a introdução de bolhas de ar. Depois de carregar as amostras e ensaios (Volume por entrada: 5 mL) executar o Load Mix roteiro script (136x) para carregar as amostras e ensaios para o chip. Depois que o script terminar, retire o chip do controlador ICF. Descasque o filme protetor azul da parte inferior do chip carregado. Remove as partículas de poeira ou detritos da superfície do chip. 4. 96,96 qRT-PCR Transferir o chip para o sistema BioMark e usar as seguintes condições de amplificação: 55 ° C por 2 min, 95 ° C por 10 min, seguido por 40 ciclos de 95 ° C por 15 s e 55 ° C por 1 min. Seguir o protocolo de fabricação para a coleta de dados software. 5. Usando o software de análise de qPCR Depois de RT-PCR o software proprietário fornece curvas de amplificação, mapas de calor e valores Ct para cada poço. Por favor, consulte o manual do software para análise de dados. 9. Resultados representativos: Figura 1. Representação esquemática do fluxo de trabalho experimental. Mostrado é uma descrição passo-a-passo do multiplex qRT-PCR protocolo, incluindo a purificação (E Step) de iniciadores excesso de transcrição reversa multiplex (Etapa C) e pré-amplificação multiplex (Passo D) antes detecção em tempo real (Passo F), resultando em um modelo de cDNA purificado por qRT-PCR. FP: primer microRNA específico para a frente, URP: primer reverso universal, R-SLP: microRNA específico reverso primário haste-laço. Clique aqui para ampliar a imagem. Figura 2. . Purificação gel Polyacryamide do modelo qRT-PCR após Bandas pré-PCR de pré-PCR tamanho do produto são exclusivamente visto em amostras WT, mas não em DGCR8 microRNA deficiente – / – ou Dicer – / – amostras (setas) após 96-plex RT e 12 ciclos de pré-amplificação. Note-se que produtos não específicos de origem desconhecida (setas) e primers excessiva são encontrados em todas as amostras (estrelas). Figura 3. Purificação após pré-amplificação multiplex muito melhora a precisão dos resultados qRT-PCR a) Comparação dos níveis de expressão relativa de WT MESC para Dgcr8 -. / – (MicroRNA canônica deficiente) revela MESC 1) a detecção de microRNAs mais e 2) a perda de falso positivo sinais em Dgcr8 – / – fundos após purificação longe primers do produto pré-PCR. b) Após purificação, os níveis de expressão relativa de ambos os DGCR8 – / – / WT e Dicer – / – / WT mostram uma perda de falso-positivos e permitem a categorização adequada dos raros Dgcr8 independente / Dicer dependentes de pequenos RNAs (miR-320, – 484, -877) 5. Figura 4. Fluidigm high-throughput perfil miRNA qRT-PCR. Exemplo screen shot de 96,96 Fluidigm perfil mircoRNA qRT-PCR para a tela de alteração nos níveis de miRNA de próstata soros de pacientes com câncer. O software em tempo real análise qPCR fornece curvas de amplificação, mapas com códigos de cores e calor limiar ciclo (Ct).
