Isolamento e cultura de células da zona nefrogênica do rim do rato embrionárias

Summary

Neste relatório nós descrevemos um método para o isolamento e cultura do nicho de células progenitoras do rim do rato embrionárias que podem ser usadas para estudar vias de sinalização que regulam tronco / progenitoras células do rim em desenvolvimento. Estas células em cultura são altamente acessível a pequenas moléculas e tratamento de proteínas recombinantes, e importante também para a transdução viral, que permite a manipulação eficiente das vias candidato.

Abstract

Desenvolvimento embrionário dos rins tem sido extensivamente estudado tanto como um modelo para a interação epitélio-mesenquimal em organogênese e conhecer melhor as origens da doença renal congênita. Mais recentemente, a possibilidade de direcção ingênua células-tronco embrionárias para destinos nefrogênica tem sido explorado no campo emergente da medicina regenerativa. Estudos genéticos no rato identificaram vários caminhos necessários para o desenvolvimento do rim, e um catálogo global da transcrição de genes do órgão foi recentemente gerado http://www.gudmap.org/ , proporcionando reguladores candidato inúmeras funções essenciais de desenvolvimento. Organogênese dos rins de roedores pode ser estudado em cultura de órgão, e muitos relatórios têm usado essa abordagem para analisar os resultados de qualquer aplicação de proteínas candidato ou derrubando a expressão de genes candidatos usando siRNA ou morpholinos. No entanto, a aplicabilidade da cultura de órgãos, para o estudo de sinalização que regula a haste / diferenciação de células progenitoras contra renovação no rim em desenvolvimento é limitado como órgãos de cultura contêm uma matriz de difusão compacto extracelular limitando de macromoléculas e partículas de vírus. Para estudar a sinalização celular eventos que influenciam a haste / nicho de células progenitoras no rim, temos desenvolvido um sistema de célula primária que estabelece a zona nefrogênica ou nicho de células progenitoras do desenvolvimento do rim vivo ex isoladamente o indutor da diferenciação epitelial. Usando a digestão enzimática limitada, as células da zona nefrogênica pode ser seletivamente liberada de desenvolver rins em E17.5. Após filtração, essas células podem ser cultivadas como uma monocamada irregular utilizando condições otimizadas. Análise gene marcador demonstra que essas culturas contêm uma distribuição de tipos de células característica da zona nefrogênica in vivo, e que mantêm a expressão do gene marcador apropriado durante o período de cultura. Estas células são altamente acessível a pequenas moléculas e tratamento de proteínas recombinantes, e importante também para a transdução viral, o que facilita muito o estudo do candidato-tronco / progenitoras efeitos regulador celular. Parâmetros de células biológicas básicas, como a proliferação e morte celular, bem como alterações na expressão de marcadores moleculares característicos de néfron tronco / progenitoras células in vivo pode ser utilizado com sucesso como os resultados experimentais. Trabalhos em curso no nosso laboratório, utilizando esta técnica celular romance principal objetivo de descobrir os mecanismos básicos que regem a regulação da auto-renovação versus diferenciação no néfron tronco / progenitoras das células.

Protocol

1. Preparando Reagentes para Digestão Kidney 1,5 ml de colagenase 0,25% A (w / v) e 1% de solução pancreatina digerir (w / v) serão necessários para a extração de células da zona nefrogênica (NZCs) de 8 E17.5 rins. Porque Pancreatina leva aproximadamente duas horas para dissolver em temperatura ambiente, o suficiente digerir solução para o maior número de rins embrionários esperado deve ser feita antes do experimento. Prepare digerir solução primeiramente adicionando 25 mg de colagenase A a 10 …

Discussion

Neste protocolo, descrevemos um método para isolar e cultivar células da zona nefrogênica do rim embrionário. É o desenvolvimento de um método inicialmente publicado como parte de um estudo dos efeitos da BMP7 tratamento em células da zona nefrogênica (Blank et al., 2009). No estudo inicial, uma série de experimentos para caracterizar os tipos de célula representada dentro da população NZC foram realizados. Resumidamente, a purificação da NZCs dos repórteres genética para o estroma cortical …

Materials

Material Name	Tipo	Company	Catalogue Number	Comment
Watchmaker’s forceps #5		Roboz	RS-4905	2 pairs required
Collagenase A		Roche	10 103 578 001	Wear mask
Porcine Pancreatin		Sigma	P8096	Wear mask
DPBS w/ Ca, Mg		Lonza	17-513F	With Mg & Ca
Fetal bovine serum (FBS)		BioWhittaker	14-901E
HBSS		Gibco	14175
KSFM		Gibco	10724-011	without added growth factors
L-Glutamine 200mM		Sigma	G7513	Use @ 1% v/v
PenStrep 10,000 U penicillin / ml 10 mg streptomycin / ml		Sigma	P4333	Use @ 1% v/v
Fibronectin		BD Biosciences	356008	Supplied as powder
24 well culture plate		Thermo Scientific	142485	Nunclon
DPBS w/o Mg & Ca		Lonza	17-512F
5mL polystyrene tubes		BD Biosciences	352235
DNase (1 U/μl)		Invitrogen	18068-015	4 μl per 1.5 ml
40 micron cell-strainer		BD Biosciences	352235	w/cap and tube
Paraformaldehyde		Sigma	P6148	Use @ 4 % w/v
Triton X100		VWR	VW3929-2	Use @ 0.3 % v/v
PBS		Sigma	P3813	Supplied as powder
Donkey serum		Jackson ImmunoResearch	017-000-121	Use @ 5 % v/v
Rabbit anti-PAX2		Invitrogen	71-6000	Dilute 1:100
Rabbit anti-β-gal		MP Biomedicals	559762	Dilute 1:200
Oregon Green 488 phalloidin		Invitrogen	O7466	Dilute 1:200
Donkey anti-rabbit Alexa Fluor 568		Invitrogen	A10042	Dilute 1:200
DAPI		Invitrogen	D1306	Dilute 1:5000
Vectashield		Vector Laboratories	H-1000
Glycerol		EMD	GX0185-6	Mix 50 % with H2O
RNeasy Micro Kit		Qiagen	74004	Use “DNase on column” protocol
Transfer pipettes, 3ml		BD Falcon	357575